पानी में तेल की बूंद assays विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान, एंजाइम विकास, और एकल सेल विश्लेषण के लिए उपयोगी हैं, लेकिन आमतौर पर बूंदों को बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स की आवश्यकता होती है। यहां, हम कण टेम्पलेट किए गए इमल्सिफिकेशन का वर्णन करते हैं, जो ड्रॉपलेट एसेस करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त दृष्टिकोण है।
मोनोडिस्पर्स्ड ड्रॉपलेट्स में की गई प्रतिक्रियाएं थोक में किए गए समकक्ष लोगों की तुलना में बढ़ी हुई सटीकता और संवेदनशीलता प्रदान करती हैं। हालांकि, नियंत्रित बूंदों को बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक्स की आवश्यकता गैर-विशेषज्ञों के लिए एक बाधा लगाती है, जिससे उनके उपयोग को सीमित किया जाता है। यहां, हम कण टेम्पलेट किए गए पायसीकरण का वर्णन करते हैं, जो माइक्रोफ्लुइडिक्स के बिना मोनोडिस्पर्स ड्रॉपलेट्स उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण है। टेम्प्लेटिंग हाइड्रोजेल क्षेत्रों का उपयोग करते हुए, हम सरल भंवर द्वारा मोनोडिस्पर्स्ड बूंदों में नमूनों को समाहित करते हैं। हम माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त डिजिटल पीसीआर करने के लिए इसका उपयोग करके दृष्टिकोण का प्रदर्शन करते हैं।
ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स थोक प्रतिक्रियाओं की तुलना में एसेस की संवेदनशीलता और सटीकता को बढ़ाने के लिए पिकोलिटर बूंदों में कंपार्टमेंटलाइजेशन का लाभ उठाता है, और रासायनिक स्क्रीनिंग, प्रोटीन इंजीनियरिंग और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण 1,2,3 में कई अनुप्रयोग हैं। उदाहरण के लिए, डिजिटल ड्रॉपलेट पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (ddPCR) थोक मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) की तुलना में बढ़ी हुई सटीकता प्रदान करता है, जिसमें कैंसर में आनुवंशिक भिन्नता के लिए अनुप्रयोग, उत्परिवर्तन पैदा करने वाली बीमारी का पता लगाने और प्रसवपूर्व निदान 4,5,6 के लिए अनुप्रयोग होते हैं। ड्रॉपलेट माइक्रोफ्लुइडिक्स की एक चुनौती, हालांकि, विभाजन के नमूनों के लिए माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों की आवश्यकता है; जबकि माइक्रोफ्लुइडिक्स ड्रॉपलेट गुणों पर उत्कृष्ट नियंत्रण प्रदान करते हैं, उन्हें 7,8 बनाने और संचालित करने के लिए विशेष विशेषज्ञता की आवश्यकता होती है। नतीजतन, ड्रॉपलेट-आधारित तरीके काफी हद तक विशेषज्ञ प्रयोगशालाओं तक सीमित हैं या, दुर्लभ उदाहरणों में, ऐसे अनुप्रयोग जिनमें एक वाणिज्यिक उपकरण उपलब्ध है9,10। ड्रॉपलेट एसेस के उपयोग को व्यापक बनाने के लिए, विशेष माइक्रोफ्लुइडिक इंस्ट्रूमेंटेशन की आवश्यकता एक बाधा है जिसे दूर किया जाना चाहिए।
इस लेख में, हम कण टेम्पलेटेड एमल्सिफिकेशन (पीटीई) का वर्णन करते हैं, जो मोनोडिस्पर्स्ड बूंदों में प्रतिक्रियाओं को करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक-मुक्त विधि है। पीटीई में, टेम्प्लेटिंग कण नमूने को वाहक तेल में बूंदों में सरल भंवर (चित्रा 1) द्वारा घेर लेते हैं। जैसा कि सिस्टम मिश्रण करता है, जलीय भाग के टुकड़े आकार को कम करने की बूंदों में तब तक होते हैं जब तक कि बूंदों में एकल कण नहीं होते हैं, जिस बिंदु पर आगे विखंडन संभव नहीं है क्योंकि इसके लिए कणों को तोड़ने की आवश्यकता होती है। घिरा हुआ नमूना कणों को बूंदों में एक खोल के रूप में घेरता है, जिससे किसी भी छितरी हुई कोशिकाओं, अभिकर्मकों, या कार्यात्मक moieties (चित्रा 1 डी) को encapsulating। इस प्रकार, पीटीई को एक सामान्य भंवर से परे बूंद प्रतिक्रियाओं को करने के लिए किसी उपकरण या विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं होती है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ मिनट या घंटों की तुलना में ड्रॉपलेट पीढ़ी में सेकंड लगते हैं, और उत्पादित राशि कंटेनर की मात्रा के लिए आनुपातिक होती है, न कि डिवाइस ऑपरेशन समय, जिससे यह अत्यधिक स्केलेबल हो जाता है। ये लाभ पीटीई को विभिन्न परिस्थितियों में बूंद assays के संचालन के लिए आदर्श बनाते हैं जिसमें माइक्रोफ्लुइडिक्स अव्यावहारिक होते हैं। यहां, हम पीटीई का प्रदर्शन करते हैं और इसका उपयोग ddPCR का संचालन करने के लिए करते हैं।
चित्र 1. कण टेम्पलेट emulsification प्रक्रिया का अवलोकन. (ए) टेम्प्लेटिंग कणों को अभिकर्मकों के साथ मिलाया जाता है। (बी) अतिरिक्त अभिकर्मकों को सेंट्रीफ्यूजेशन के बाद हटा दिया जाता है। (C) टेम्पलेट अणुओं का जोड़ तेल के अतिरिक्त होने से पहले होता है। (डी) भंवर एक एकल टेम्पलेट अणु युक्त बूंदों का उत्पादन करता है। (ई) बाद में थर्मोसाइक्लिंग और इमेजिंग लक्ष्य टेम्पलेट के डिजिटल ड्रॉपलेट विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पीटीई भंवर द्वारा monodispersed बूंदों में नमूनों encapsulate करने के लिए कणों का उपयोग करता है। इसकी सादगी और पहुंच के अलावा, पीटीई कई अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है, जिसमें बड़ी मात्रा में बूंदों को तात्कालिक रूप से उत्पन्न करने की अनुमति देना शामिल है। इसके अलावा, प्रक्रिया को एक अलग ट्यूब में आयोजित किया जा सकता है, जो माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में नमूनों को स्थानांतरित करने, समग्र वर्कफ़्लो को सुव्यवस्थित करने और नमूना संदूषण या हानि के अवसरों को सीमित करने की आवश्यकता को कम करता है। टेम्प्लेटिंग कण भी एक साधन प्रदान करते हैं जिसके द्वारा परिणामी बूंद प्रतिक्रियाओं की सामग्री को इंजीनियर किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, कण आकार, रसायन विज्ञान, और नम्रता को लक्षित बायोमोलेक्यूल या सेल कैप्चर के लिए इंजीनियर किया जा सकता है, जबकि एंजाइम, एक्टिव्स, या न्यूक्लिक एसिड जैसे कार्यात्मक moieties, प्रतिक्रियाओं को सुविधाजनक बनाने के लिए कण पर प्रदर्शित किया जा सकता है, जैसे कि एकल सेल अनुक्रमण या कार्यात्मक लक्षण वर्णन के लिए। जबकि दृष्टिकोण लचीला है, फिर भी इसके उपयोग के लिए महत्वपूर्ण बाधाएं हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान में ड्रॉपलेट परिवर्धन करना संभव नहीं है जैसा कि अक्सर माइक्रोफ्लुइडिक्स के साथ आयोजित किया जाता है, जिसके लिए आवश्यक है कि सभी प्रतिक्रिया घटकों को एनकैप्सुलेशन से पहले पेश किया जाए; इसके लिए आवश्यक है कि अभिकर्मकों को तब तक संगत और स्थिर किया जा सकता है जब तक कि बूंदों को उत्पन्न नहीं किया जा सकता है और, परेशानी वाले संयोजनों के मामले में, अक्सर बर्फ पर नमूने को जल्दी से मिश्रण और emulsifying द्वारा संबोधित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, प्रतिक्रियाशील घटक जिन्हें प्रकाश या गर्मी के साथ बाहरी रूप से ट्रिगर किया जा सकता है, उनका उपयोग किया जा सकता है13। पीटीई इस प्रकार गैर-विशेषज्ञों के लिए सुलभ ड्रॉपलेट एसेस के संचालन के लिए एक लचीला और स्केलेबल तरीका प्रदान करता है। यह, अपनी जन्मजात सादगी और लचीलेपन के साथ युग्मित, पीटीई को कई बूंद अनुप्रयोगों के निष्पादन और विकास के लिए आदर्श बनाता है।
The authors have nothing to disclose.
इस प्रोटोकॉल को विकसित करने वाले इस काम को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (R01-EB019453-02), राष्ट्रीय खुफिया के निदेशक के कार्यालय, Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507) के माध्यम से इंटेलिजेंस एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एक्टिविटी, चैन-जुकरबर्ग बायोहब इन्वेस्टिगेटर प्रोग्राम, टेक्सास ए एंड एम यूनिवर्सिटी (W911NF1920013) के माध्यम से रक्षा उन्नत अनुसंधान परियोजनाएं एजेंसी, और जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय के माध्यम से रोग नियंत्रण और रोकथाम के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था। भौतिकी प्रयोगशाला (75D30-11-9C-06818 (CDC3))। यहां निहित विचार और निष्कर्ष लेखकों के हैं और उन्हें आवश्यक रूप से उपरोक्त संगठनों या अमेरिकी सरकार की आधिकारिक नीतियों, या तो व्यक्त या निहित, का प्रतिनिधित्व करने के रूप में व्याख्या नहीं की जानी चाहिए। अमेरिकी सरकार किसी भी कॉपीराइट एनोटेशन के बावजूद सरकारी उद्देश्यों के लिए पुनर्मुद्रण को पुन: पेश करने और वितरित करने के लिए अधिकृत है।
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
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Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
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EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |