Vann-i-olje dråpeanalyser er nyttige for analytisk kjemi, enzymutvikling og enkeltcelleanalyse, men krever vanligvis mikrofluidikk for å danne dråpene. Her beskriver vi partikkelmalt emulgering, en mikrofluidfri tilnærming for å utføre dråpeanalyser.
Reaksjoner utført i monodispersed dråper gir forbedret nøyaktighet og følsomhet sammenlignet med tilsvarende som utføres i bulk. Imidlertid pålegger kravet om mikrofluidikk å danne kontrollerte dråper en barriere for ikke-eksperter, noe som begrenser bruken av dem. Her beskriver vi partikkelmalt emulgering, en tilnærming for å generere monodisperse dråper uten mikrofluidikk. Ved hjelp av fristende hydrogelkuler innkapsler vi prøver i monodisperserte dråper ved enkel virvelsetting. Vi demonstrerer tilnærmingen ved å bruke den til å utføre mikrofluidisk-fri digital PCR.
Mikrofluidikk i dråper utnytter oppdeling i picoliterdråper for å øke følsomheten og nøyaktigheten til analysene sammenlignet med bulkreaksjoner, og har mange bruksområder innen kjemisk screening, proteinteknikk og neste generasjons sekvensering1,2,3. For eksempel gir digital dråpepolymerasekjedereaksjon (ddPCR) økt nøyaktighet sammenlignet med bulk kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR), med anvendelser for genetisk variasjon i kreft, påvisning av sykdom som forårsaker mutasjoner og prenatal diagnostikk4,5,6. En utfordring med mikrofluidikk fra dråper er imidlertid kravet om mikrofluidiske enheter for å partisjonere prøver; mens mikrofluidikk gir utmerket kontroll over dråpeegenskaper, krever de spesialisert ekspertise for å bygge og operere7,8. Derfor er dråpebaserte metoder i stor grad begrenset til ekspertlaboratorier eller, i sjeldne tilfeller, applikasjoner der et kommersielt instrument er tilgjengelig9,10. For å utvide bruken av dråpeanalyser er kravet til spesialisert mikrofluidisk instrumentering et hinder som må overvinnes.
I denne artikkelen beskriver vi partikkelmalt emulgering (PTE), en mikrofluidfri metode for å utføre reaksjoner i monodisperserte dråper. I PTE oppsluker fristende partikler prøven i dråper i bærerolje ved enkel virvelsetting (figur 1). Når systemet blandes, fragmenterer den vandige delen i dråper med redusert størrelse til dråpene inneholder enkle partikler, og da er ytterligere fragmentering ikke mulig fordi det krever å bryte partiklene. Den oppslukte prøven omgir partiklene som et skall i dråpene, og innkapsler dermed eventuelle dispergerte celler, reagenser eller funksjonelle moieties (figur 1D). Derfor krever PTE ikke noe utstyr eller ekspertise for å utføre dråpereaksjoner utover en vanlig virvel. I tillegg tar dråpegenerering sekunder sammenlignet med minutter eller timer med mikrofluidikk, og mengden som produseres er proporsjonal med beholdervolumet, ikke enhetens driftstid, noe som gjør den ekstremt skalerbar. Disse fordelene gjør PTE ideell for å gjennomføre dråpeanalyser under en rekke omstendigheter der mikrofluidikk er upraktisk. Her demonstrerer vi PTE og bruker den til å utføre ddPCR.
Figur 1. Oversikt over partikkelmalt emulgeringsprosess. (A) Fristende partikler blandes med reagenser. (B) Overflødige reagenser fjernes etter sentrifugering. (C) Tilsetning av malmolekyler skjer før tilsetning av olje. (D) Vortexing produserer dråper som inneholder et enkelt malmolekyl. (E) Etterfølgende termosycling og avbildning muliggjør digital dråpeanalyse av målmal. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
PTE bruker partikler til å innkapsle prøver i monodisperserte dråper ved virveling. I tillegg til enkelhet og tilgjengelighet gir PTE flere ekstra fordeler, inkludert å tillate at store mengder dråper genereres øyeblikkelig. Videre kan prosessen utføres i et isolert rør, noe som hindrer behovet for å overføre prøver til mikrofluidiske enheter, effektivisere den generelle arbeidsflyten og begrense mulighetene for prøveforurensning eller tap. De fristende partiklene gir også et middel for å konstruere innholdet i de resulterende dråpereaksjonene. For eksempel kan partikkelstørrelse, kjemi og fuktbarhet konstrueres for målrettet biomolekyl eller cellefangst, mens funksjonelle moieties som enzymer, aktive eller nukleinsyrer, kan vises på partikkel for å lette reaksjoner, for eksempel for enkeltcellesekvensering eller funksjonell karakterisering. Selv om tilnærmingen er fleksibel, er det likevel viktige begrensninger for bruken. For eksempel er det for tiden ikke mulig å utføre dråpetilsetninger som ofte utføres med mikrofluidikk, noe som krever at alle reaksjonskomponenter innføres før innkapsling; Dette krever at reagenser er kompatible og stabile til dråpene kan genereres, og i tilfelle plagsomme kombinasjoner kan det ofte løses ved raskt å blande og emulgere prøven på is. Alternativt kan reaktive komponenter som kan utløses eksternt med lys eller varme brukes13. PTE gir dermed en fleksibel og skalerbar metode for å gjennomføre dråpeanalyser som er tilgjengelige for ikke-eksperter. Dette, kombinert med sin medfødte enkelhet og fleksibilitet, gjør PTE ideell for utførelse og utvikling av mange dråpeapplikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet med å utvikle denne protokollen ble støttet av National Institutes of Health (R01-EB019453-02), kontoret til direktøren for nasjonal etterretning, Intelligens Avanserte forskningsprosjekter Aktivitet gjennom Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency gjennom Texas A&M University (W911NF1920013), og Centers for Disease Control and Prevention gjennom Johns Hopkins University Applied Fysikk Laboratorium (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Synspunktene og konklusjonene i dette dokumentet er forfatternes synspunkter og bør ikke tolkes som nødvendigvis å representere den offisielle politikken, enten uttrykt eller underforstått, av de ovennevnte organisasjonene eller den amerikanske regjeringen. Den amerikanske regjeringen er autorisert til å reprodusere og distribuere reprints for statlige formål til tross for eventuelle opphavsrettsmerknader der.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |