Vatten-i-olja droppanalyser är användbara för analytisk kemi, enzymutveckling och encellsanalys, men kräver vanligtvis mikrofluidik för att bilda dropparna. Här beskriver vi partikel mallad emulgering, en mikrofluidisk-fri strategi för att utföra droppanalyser.
Reaktioner som utförs i monodispersed droppar ger förbättrad noggrannhet och känslighet jämfört med motsvarande som utförs i bulk. Kravet på mikrofluidik för att bilda kontrollerade droppar utgör dock ett hinder för icke-experter, vilket begränsar deras användning. Här beskriver vi partikelmallad emulgering, ett tillvägagångssätt för att generera monodisperse droppar utan mikrofluidik. Med hjälp av frestande hydrogelsfärer kapslar vi in prover i monodisperserade droppar genom enkel virvel. Vi demonstrerar tillvägagångssättet genom att använda det för att utföra mikrofluidisk-fri digital PCR.
Droplet mikrofluidik utnyttjar compartmentalization i picoliter droppar för att öka känsligheten och noggrannheten i analyser jämfört med bulkreaktioner, och har många tillämpningar inom kemisk screening, proteinteknik, och nästa generations sekvensering1,2,3. Till exempel ger digital dropppolymeraskedjereaktion (ddPCR) ökad noggrannhet jämfört med bulk kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR), med tillämpningar för genetisk variation i cancer, påvisande av sjukdomar som orsakar mutationer och prenatal diagnostik4,5,6. En utmaning med droppmikrofluidik är dock kravet på mikrofluidiska anordningar för att dela prover. medan mikrofluidik ger utmärkt kontroll över droppegenskaper, kräver de specialiserad expertis för att bygga och driva7,8. Följaktligen är droppbaserade metoder till stor del begränsade till expertlaboratorier eller, i sällsynta fall, applikationer där ett kommersiellt instrument finns tillgängligt9,10. För att bredda användningen av droppanalyser är kravet på specialiserad mikrofluidisk instrumentering ett hinder som måste övervinnas.
I den här artikeln beskriver vi Particle Templated Emulsification (PTE), en mikrofluidisk-fri metod för att utföra reaktioner i monodispersed droppar. I PTE slukar frestande partiklar provet till droppar i bärarolja genom enkel virvel (figur 1). När systemet blandas fragmenterar vattendelen i droppar av reducerande storlek tills dropparna innehåller enstaka partiklar, då ytterligare fragmentering inte är möjlig eftersom det kräver att partiklarna bryts. Det uppslukade provet omger partiklarna som ett skal i dropparna och kapslar därmed in spridda celler, reagenser eller funktionella munterier (figur 1D). PTE kräver således ingen utrustning eller expertis för att utföra droppreaktioner utöver en vanlig virvel. Dessutom tar droppgenerering sekunder jämfört med minuter eller timmar med mikrofluidik, och mängden som produceras är proportionell mot behållarens volym, inte enhetens driftstid, vilket gör den ytterst skalbar. Dessa fördelar gör PTE idealisk för att genomföra droppanalyser under en mängd olika omständigheter där mikrofluidik är opraktiska. Här demonstrerar vi PTE och använder den för att utföra ddPCR.
Figur 1. Översikt över partikelmallad emulgeringsprocess. A) Templatingpartiklar blandas med reagenser. B) Överskott av reagenser avlägsnas efter centrifugering. (C) Tillsats av mallmolekyler sker före tillsats av olja. D) Virveling producerar droppar som innehåller en enda mallmolekyl. (E) Efterföljande termocykling och avbildning möjliggör digital droppanalys av målmallen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
PTE använder partiklar för att kapsla in prover i monodisperserade droppar genom virvel. Förutom sin enkelhet och tillgänglighet ger PTE flera ytterligare fördelar, inklusive att låta stora volymer droppar genereras omedelbart. Dessutom kan processen utföras i ett isolerat rör, vilket undanröjer behovet av att överföra prover till mikrofluidiska enheter, effektivisera det övergripande arbetsflödet och begränsa möjligheterna till provkontaminering eller förlust. De frestande partiklarna ger också ett sätt att konstruera innehållet i de resulterande droppreaktionerna. Till exempel kan partikelstorlek, kemi och vätbarhet konstrueras för riktad biomolekyl eller cellfångst, medan funktionella moieties som enzymer, aktiva eller nukleinsyror kan visas på partikel för att underlätta reaktioner, till exempel för encellssekvensering eller funktionell karakterisering. Även om tillvägagångssättet är flexibelt finns det ändå viktiga begränsningar för dess användning. Det är till exempel för närvarande inte möjligt att utföra dropptillskott som ofta utförs med mikrofluidik, vilket kräver att alla reaktionskomponenter införs före inkapsling. Detta kräver att reagenser är kompatibla och stabila tills dropparna kan genereras och, när det gäller besvärliga kombinationer, ofta kan åtgärdas genom att snabbt blanda och emulgera provet på is. Alternativt kan reaktiva komponenter som kan utlösas externt med ljus eller värme användas13. PTE ger därmed en flexibel och skalbar metod för att genomföra droppanalyser som är tillgängliga för icke-experter. Detta, i kombination med dess medfödda enkelhet och flexibilitet, gör PTE idealiskt för utförande och utveckling av många droppapplikationer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete med att utveckla detta protokoll stöddes av National Institutes of Health (R01-EB019453-02), kontoret för direktören för nationell intelligens, intelligens avancerade forskningsprojekt aktivitet genom Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), Chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, Defense Advanced Research Projects Agency genom Texas A&M University (W911NF1920013), Fysiklaboratoriet (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). De åsikter och slutsatser som finns häri är författarnas och bör inte tolkas som att de nödvändigtvis representerar den officiella politiken, antingen uttryckt eller underförstådd, av ovanstående organisationer eller den amerikanska regeringen. Den amerikanska regeringen har rätt att reproducera och distribuera omtryck för statliga ändamål trots alla upphovsrättsanteckningar däri.
0.22 um syringe filter | Milipore Sigma | SLGP033RS | |
0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15575020 | |
0.75 mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
1 mL syringes | BD | 309628 | |
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO) | Sigma-Aldrich | 370533 | |
1M Tris-HCI, pH 8.0 | Thermo-Fisher | 15568025 | |
27 gauge needles | BD | 305109 | |
3" silicon wafers, P type, virgin test grade | University Wafers | 447 | |
3D-printed centrifuge syringe holder | (custom) | (custom) | |
Acrylamide solution,40%, for electrophoresis, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | A4058-100ML | |
Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | A3678-25G | |
Aquapel (fluorinated surface treatment) | Pittsburgh Glass Works | 47100 | |
Hexane | Sigma-Aldrich | 139386 | |
FC-40 fluorinated oil | Sigma-Aldrich | F9755 | |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 109827 | |
N,N′-Methylenebis(acrylamide) | Sigma-Aldrich | 146072-100G | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Novec-7500 Engineering Fluid (HFE oil) | 3M | 98-0212-2928-5 | |
polyethylene tubing | Scientific Commodities | B31695-PE/2 | |
fluorosurfactant | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
PGMEA developer | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Photomasks | CadArt Servcies | (custom) | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Spin coater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
Span 80 (sorbitane monooleate) | Sigma-Aldrich | s6760 | |
SU-8 3025 photoresist | Kayaku | 17030192 | |
Triton X-100 (octylphenol ethoxylate) | Sigma-Aldrich | t8787 | |
Tween 20 (polysorbate 20) | Sigma-Aldrich | p2287 | |
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix) | Applied Biosystems | 4464263 | |
Yeast FWD | IDT | 5′-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′ | |
Yeast REV | IDT | 5′-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA AC-3 |
|
Yeast Probe | IDT | 5′-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk FQ/-3′ |
|
EVOS FL AUTO | Life Technologies | ||
EVOS LED Cube, GFP | Life Technologies | AMEP4651 | |
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (PDMS base and curing reagents) | Dow Corning | DC4019862 | |
TEMED | Thermo Fisher | 17919 | |
Saccharomyces cerevisiae genomic DNA | Milipore | 69240-3 | |
Expanded plasma cleaner (plasma bonder) | Harrick Plasma | PDC-002 (230V) |