Modellierung der Hirnmetastasierung durch Injektion von entzündlichen Brustkrebszellen in die Schwanzvene
Summary
Wir beschreiben ein Xenotransplantat-Mausmodell für Brustkrebs-Hirnmetastasen, die durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten entzündlichen Brustkrebszelllinie erzeugt werden.
Abstract
Die Metastasierung im Gehirn ist eine häufige und verheerende Manifestation vieler Krebsarten. Allein in den Vereinigten Staaten werden jedes Jahr etwa 200.000 Patienten mit Hirnmetastasen diagnostiziert. Bei der Verbesserung der Überlebenschancen von Patientinnen mit primärem Brustkrebs und systemischen Malignomen wurden erhebliche Fortschritte erzielt. Die düstere Prognose für Patienten mit klinischen Hirnmetastasen unterstreicht jedoch die dringende Notwendigkeit, neue Therapeutika und Strategien gegen diese tödliche Krankheit zu entwickeln. Der Mangel an geeigneten experimentellen Modellen war eine der größten Hürden, die den Fortschritt unseres Verständnisses der Biologie und Behandlung von Hirnmetastasen behinderten. In dieser Arbeit beschreiben wir ein Xenotransplantat-Mausmodell der Hirnmetastase, das durch Schwanzveneninjektion einer endogen HER2-amplifizierten Zelllinie aus entzündlichem Brustkrebs (IBC), einer seltenen und aggressiven Form von Brustkrebs, erzeugt wird. Die Zellen wurden mit Glühwürmchen-Luciferase und grünem Fluoreszenzprotein markiert, um die Hirnmetastasierung zu überwachen, und die Metastasenbelastung durch Biolumineszenz-Bildgebung, Fluoreszenzstereomikroskopie und histologische Auswertung quantifiziert. Mäuse entwickeln robust und konsistent Hirnmetastasen, was die Untersuchung von Schlüsselmediatoren im Metastasierungsprozess und die Entwicklung präklinischer Tests neuer Behandlungsstrategien ermöglicht.
Introduction
Hirnmetastasen sind eine häufige und tödliche Komplikation systemischer Malignome. Die meisten Hirnmetastasen haben ihren Ursprung in Primärtumoren der Lunge, der Brust oder der Haut, die zusammen 67-80% der Fälle ausmachen 1,2. Die Schätzungen der Häufigkeit von Hirnmetastasen schwanken zwischen 100.000 und 240.000 Fällen, und diese Zahlen könnten unterschätzt sein, da eine Autopsie bei Patienten, die an metastasierendem Krebs gestorben sind, selten ist3. Patienten mit Hirnmetastasen haben eine schlechtere Prognose und ein geringeres Gesamtüberleben im Vergleich zu Patienten ohne Hirnmetastasen4. Die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten für Hirnmetastasen sind weitgehend palliativ und können die Überlebenschancen der meisten Patienten nicht verbessern5. Daher bleibt die Hirnmetastasierung eine Herausforderung, und es bleibt dringend, die Mechanismen des Fortschreitens von Hirnmetastasen besser zu verstehen, um wirksamere Therapien zu entwickeln.
Die Verwendung experimenteller Modelle lieferte wichtige Einblicke in spezifische Mechanismen der Metastasierung von Brustkrebs in das Gehirn und ermöglichte die Bewertung der Wirksamkeit verschiedener Therapieansätze 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Allerdings gibt es nur sehr wenige Modelle, die die Feinheiten der Entwicklung von Hirnmetastasen genau und vollständig rekapitulieren können. Mehrere experimentelle In-vivo-Modelle wurden durch Inokulation von Krebszellen in Mäuse auf verschiedenen Verabreichungswegen erzeugt, einschließlich orthotoper, Schwanzvenen-, intrakardialer, intrakardialer Arterien- und intrazerebraler Injektionen. Jede Technik hat Vor- und Nachteile, wie an anderer Stelle erläutert3. Keines dieser Mausmodelle kann jedoch den klinischen Verlauf der Hirnmetastasierung vollständig nachbilden.
Hirnmetastasen treten besonders häufig bei Patientinnen mit entzündlichem Brustkrebs (IBC) auf, einer seltenen, aber aggressiven Variante des primären Brustkrebses. IBC macht 1 % bis 4 % der Brustkrebsfälle aus, ist aber für unverhältnismäßig hohe 10 % der brustkrebsbedingten Todesfälle in den Vereinigten Staaten verantwortlich17,18. Es ist bekannt, dass IBC schnell metastasiert; Tatsächlich hat ein Drittel der IBC-Patienten zum Zeitpunkt der Diagnose Fernmetastasen19,20. Spezifisch für Hirnmetastasen haben Patienten mit IBC eine höhere Inzidenz von Hirnmetastasen als Patienten mit Nicht-IBC21. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die MDA-IBC3-Zelllinie, die aus der malignen Pleuraergussflüssigkeit eines Patienten mit ER-/PR-/HER2+-IBC gewonnen wird, die IBC-Eigenschaften in Maus-Xenotransplantaten rekapituliert, eine erhöhte Neigung zur Entwicklung von Hirnmetastasen anstelle von Lungenmetastasen bei Mäusen aufweist, wenn sie über eine Schwanzvene injiziert wird, was diese Zelllinie zu einem guten Modell für die Untersuchung der Entwicklung von Hirnmetastasen macht16.
In dieser Arbeit beschreiben wir die Verfahren zur Erzeugung von Hirnmetastasen durch Schwanzveneninjektion von MDA-IBC3-Zellen und zur Bewertung der Metastasenbelastung mittels Stereofluoreszenzmikroskopie und Luciferase-Bildgebung. Diese Methode wurde verwendet, um Schlüsselmediatoren der Metastasierung von Brustkrebs im Gehirn zu entdecken und die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu testen 16,22,23. Der Nachteil dieser Technik ist, dass sie nicht alle Schritte des Metastasierungsprozesses des Gehirns rekapituliert. Zu den Hauptvorteilen gehören jedoch die Robustheit und Reproduzierbarkeit, die Einbeziehung der relevanten Metastasenbiologie der Intravasation, die Durchquerung der Lunge und die Extravasation in das Gehirn sowie die relative Einfachheit in Bezug auf die Technik.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Protokoll umfasst mehrere kritische Schritte. Die Zellen sollten nicht länger als 1 Stunde auf Eis gelegt werden, um die Lebensfähigkeit zu erhalten. Alkoholwattepads sollten verwendet werden, um die Schwänze der Mäuse vor der Injektion abzuwischen, wobei darauf zu achten ist, dass nicht zu stark oder zu oft abgewischt wird, um die Schwanzhaut nicht zu beschädigen. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen in der Zellsuspension vorhanden sind, um zu verhindern, dass Mäuse an Blutgefäßembolien sterben. Halten …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Christine F. Wogan, MS, ELS, von MD Anderson’s Division of Radiation Oncology für die wissenschaftliche Bearbeitung des Manuskripts und Carol M. Johnston von MD Anderson’s Division of Surgery Histology Core für die Hilfe bei der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung. Wir danken dem Veterinärmedizin- und Chirurgiezentrum von MD Anderson für die Unterstützung der Tierversuche. Diese Arbeit wurde durch die folgenden Stipendien unterstützt: Susan G. Komen Career Catalyst Research Grant (CCR16377813 an BGD), American Cancer Society Research Scholar Grant (RSG-19-126-01 an BGD) und das State of Texas Rare and Aggressive Breast Cancer Research Program. Teilweise auch unterstützt durch den Cancer Center Support (Core) Grant P30 CA016672 des National Cancer Institute, National Institutes of Health, an das MD Anderson Cancer Center der University of Texas.
Materials
| Cell Culture | |||
| 1000 µL pipette tip filtered | Genesee Scientific | 23430 | |
| 10 mL Serological Pipets | Genesee Scientific | 12-112 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% |
| Centrifuge tubes 15 mL bulk | Genesee Scientific | 28103 | |
| Corning 500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine | GIBICO Inc. USA | MT10080CV | |
| Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen) | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 21-031-CV | |
| Eppendorf centufuge 5810R | Eppendorf | ||
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBICO Inc. USA | 16000044 | 10% |
| Fisherbrand Sterile Cell Strainers (40 μm) | Thermo Fisher Scientific | 22-363-547 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | 1 µg/mL |
| Insulin | Thermo Fisher Scientific | 12585014 | 5 µg/mL |
| Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| MDA-IBC3 cell lines | MD Anderson Cancer Center | Generated by Dr. Woodward's lab24 | |
| Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid | System Biosciences | BLIV713PA-1 | |
| microtubes clear sterile 1.7 mL | Genesee Scientific | 24282S | |
| Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile | Genesee Scientific | 23-401C | |
| TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent | Genesee Scientific | 25-209 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Tail vein injection | |||
| C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J – SCID/Beige | Envigo | SCID/beige mice | |
| BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm) | BD | 328466 | |
| Plas Labs Broome-Style Rodent Restrainers | Plas Labs 551BSRR | 01-288-32A | Order fromThermo Fisher Scientific |
| Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof) | Thermo Fisher Scientific | 50420872 | 70 % used |
| Imaging | |||
| BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| Disposable PES Filter Units 0.45 µm | Fisherbrand | FB12566501 | filter system to sterilize the D-luciferin |
| D-Luciferin | Biosynth | L8220-1g | stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL |
| 1.7 mL microtube amber | Genesee Scientific | 24-282AM | |
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC-14043-704-06 | Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer |
| IVIS 200 | PerkinElmer | machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine | |
| Plastic Containers with Lids | Fisherbrand | 02-544-127 | |
| Tissue Cassettes | Thermo Scientific | 1000957 | |
| Webcol Alcohol Prep | Covidien | 6818 | |
| Stereomicroscope Imaging | |||
| Stereomicroscope AZ100 | Nikon | model AZ-STGE | software NIS-ELEMENT |
| Formalin 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| TC treated dishes 100×20 mm | Genesee Scientific | 25202 |
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