De presenterade protokollen kan användas för att karakterisera svaret av fluorescerande märkta mikrobubblor utformade för ultraljud-utlösta läkemedelsleveransapplikationer, inklusive deras aktiveringsmekanismer samt deras bioeffects. Detta dokument täcker en rad in vitro- och in vivo-mikroskopitekniker som utförs för att fånga relevanta längd- och tidsskalor.
Microbubble kontrastmedel håller stort löfte för läkemedelsleverans applikationer med ultraljud. Inkapsling av läkemedel i nanopartiklar minskar systemisk toxicitet och ökar cirkulationstiden för drogerna. I en ny metod för mikrobubble-assisterad läkemedelsleverans, nanopartiklar införlivas i eller på microbubble skal, vilket möjliggör lokal och utlöst frisättning av nanopartikel nyttolasten med ultraljud. En grundlig förståelse av frisättningsmekanismerna inom det stora ultraljudsparameterutrymmet är avgörande för effektiv och kontrollerad frisättning. Denna uppsättning presenterade protokoll är tillämpliga på mikrobubblor med ett skal som innehåller en fluorescerande etikett. Här ligger fokus på mikrobubblor laddade med poly(2-etyl-butylcyanoakrylat) polymera nanopartiklar, dopade med ett modifierat Nile Red-färgämne. Partiklarna fixeras i ett denaturerat kaseinskal. Mikrobubblorna produceras genom kraftig omrörning och bildar en spridning av perfluorpropangas i vätskefasen som innehåller kasein och nanopartiklar, varefter mikrobubbleskalet självmonteras. En mängd olika mikroskopitekniker behövs för att karakterisera nanopartikelstabiliserade mikrobubblor vid alla relevanta tidsskalor i nanopartikelfrisättningsprocessen. Fluorescens av nanopartiklarna möjliggör konfokal avbildning av enstaka mikrobubblor, vilket avslöjar partikelfördelningen i skalet. In vitro ultra-höghastighets avbildning med ljusfält mikroskopi vid 10 miljoner bilder per sekund ger insikt i bubbla dynamiken som svar på ultraljuds insonation. Slutligen visualiseras nanopartikelfrisättning från bubbelskalet bäst med hjälp av fluorescensmikroskopi, utförd vid 500 000 bilder per sekund. För att karakterisera läkemedelsleverans in vivo studeras den utlösta frisättningen av nanopartiklar inom vaskulaturen och deras extravasation bortom endotelskiktet med intravital mikroskopi i tumörer implanterade i dorsala hudveck fönsterkammare, över en tidsskala på flera minuter. Kombinationen av dessa kompletterande karakteriseringstekniker ger unik inblick i beteendet hos mikrobubblor och deras nyttolastutgivning på en rad tids- och längdskalor, både in vitro och in vivo.
Ultraljud är den mest använda medicinska bildtekniken. Det är icke-invasivt, snabbt, säkert, kostnadseffektivt och bärbart1,2,3. Blod är dock en dålig ultraljudsspridare, och kontrasten i blodpoolen kan förbättras genom en intravenös injektion av ultraljud kontrastmedel3. Denna förbättrade blodpoolkontrast möjliggör kvantifiering av organperfusion för diagnostiska ändamål, t.ex. vid påvisande av kranskärlssjukdom4 och metastaserad leversjukdom5. Tumör vaskulatur visade sig vara en viktig prognostisk faktor6. En stor forskningsinsats riktas nu mot mikrobubble-assisterade, riktade molekylära avbildningar och skräddning av kontrastmedel för terapeutisk användning.
Kommersiellt tillgängliga ultraljud kontrastmedel består vanligtvis av en suspension av belagda mikrobubblor7,8 med diametrar som sträcker sig från 1 μm till 10 μm9. Eftersom ultraljud kontrastmedel mikrobubblor är något mindre än röda blodkroppar7, kan mikrobubblorna säkert nå även de minsta kapillärerna utan att skapa en ocklusion3. Microbubbles har en dramatiskt ökad ultraljud backscattering koefficient jämfört med vävnad10, på grund av deras komprimerbara gas core11. Dessutom är mikrobubbleekoet mycket ickelinjärt, dvs. Dessutom är ekostyrkan starkt beroende av den resonanta reaktionen från bubblan12. Medan vävnaden endast sprider sig linjärt, är ett litet antal mikrobubblor tillräckliga för att uppnå en hög detektionskänslighet vid harmonisk avbildning13,14. Denna icke-linjära kontrastgenerering kan till och med vara tillräckligt stark för att spåra enstaka bubblor i kroppen15.
Skalet av ultraljud kontrastmedel stabiliserar bubblorna mot upplösning och coalescence, vilket ökar deras cirkulationstid i blodpoolen16. Skalet kan bestå av lipider, polymerer eller denaturerade proteiner3,8. Det minskar den interfacial spänningen, vilket begränsar effekten av Laplace tryckdriven upplösning17 och skapar en resistiv barriär mot gasspridning18. För att ytterligare öka stabiliteten fylls kontrastmikrobubblorna vanligtvis med en gas med hög molekylvikt med låg löslighet i blod11. Microbubble skal förändrar dramatiskt svaret av microbubbles till ultraljud insonation11. Obelagda gasbubblor har en karakteristisk resonansfrekvens som är omvänt proportionell mot deras storlek och tillsatsen av en lipidbeläggning ökar resonansfrekvensen med avseende på en obestruken bubbla på grund av skalets inneboende styvhet. Dessutom avleder skalet energi genom dilatationell viskositet, vilket utgör den dominerande källan till dämpning för belagda bubblor3. Stabiliseringsskalet har den extra fördelen att det kan funktionaliseras, t.ex. genom att binda inriktningen på ligands till ytan av mikrobubblor. Denna inriktning möjliggör många tillämpningar för dessa bubblor och i synnerhet molekylär avbildning med ultraljud14,19.
Microbubble kontrastmedel håller stort löfte för läkemedelsleverans applikationer med ultraljud. Mikrobubblor som oscillerar i inneslutningen av ett blodkärl kan orsaka mikroströming samt lokala normala och skjuvningsspänningar på kapillärväggen3. Vid högt akustiskt tryck kan stora amplitudsvängningar leda till mikrobubble kollaps i en våldsam process som kallas inertiell kavitation, vilket i sin tur kan leda till bristning eller invagination av blodkärlet20. Dessa våldsamma fenomen kan inducera bioeffects såsom sonopermeation21, förbättra extravasation av terapeutiska läkemedel i interstitium över endotelväggen, antingen paracellulärt eller transcellularly. det kan också förbättra penetrationen av terapeutiska medel genom den extracellulära matrisen av stroma-rika tumörer21,22 och biofilmer23,24, även om denna mekanism fortfarande är dåligt förstådd26.
Ultraljudsmedierad läkemedelsleverans har visat lovande resultat både prekliniskt27,28 och i kliniska prövningar22. Dessutom, när de används med relativt lågfrekvent ultraljud (~ 1 MHz), mikrobubblor har rapporterats för att lokalt och tillfälligt öka blod – hjärnbarriären permeabilitet, vilket gör det möjligt för läkemedel att komma in i hjärnan parenkym, både i prekliniska och kliniska studier29,30,31,32,33,34.
Det finns i allmänhet två metoder för ultraljudsmedierad läkemedelsleverans: det terapeutiska materialet kan administreras tillsammans med bubblorna, eller det kan fästas vid eller laddas i bubbelskalet28,35,36. Det andra tillvägagångssättet har visat sig vara mer effektivt när det gäller läkemedelsleverans37. Mikrobubblor kan laddas med läkemedel eller genetiskt material inkapslat i nanopartiklar (liposomer eller polymera nanokonstruktioner) som fästs på skalet eller införlivas direkt i mikrobubbleskalet35,36. Nanopartikelbelastade mikrobubblor kan aktiveras med (fokuserad) ultraljud för att lokalt frigöra nanopartikelns nyttolast28,33,38,39,40. Om en sådan mikrobubble är i direkt kontakt med en cell har det visats in vitro att nyttolasten till och med kan deponeras på cellens cytoplasmiska membran i en process som kallas sonoprinting34,35.
Ultraljud parameter utrymme för microbubble insonation är omfattande, och in vivo biologiska villkor ytterligare lägga komplexitet. Således utgör kombinationen av fokuserad ultraljud och nanopartikel-laddade mikrobubblor en utmaning inom området riktade terapier.
Syftet med detta arbete är att tillhandahålla protokoll som kan användas för att i detalj avbilda svaret från mikrobubblor som en funktion av ultraljudsparametrarna och att studera mekanismerna som leder till skalbrott och efterföljande frisättning av det fluorescerande märkta skalmaterialet. Denna uppsättning protokoll är tillämpliga på mikrobubblor med skal som innehåller ett fluorescerande färgämne. Figur 1 visar en schematisk representation av de polymera nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor som utvecklats vid SINTEF (Trondheim, Norge). Dessa bubblor är fyllda med perfluorpropangas (C3F8) och nanopartiklarna som stabiliserar skalet innehåller NR668, som är ett lipofilt derivat av Nile Red fluorescerande färgämne38,43. Nanopartiklarna består av poly(2-etyl-butylcyanoakrylat) (PEBCA) och är PEGylated. Funktionalisering med polyetylenglykol (PEG) minskar opsonization och fagocytos genom det mononukleära fagocytsystemet, vilket förlänger cirkulationstiden14,44. Som ett resultat ökar PEGylation mängden nanopartiklar som når målplatsen och förbättrar därmed effekten av behandlingen16. Figur 2 illustrerar hur användningen av fyra mikroskopimetoder gör det möjligt för forskare att täcka alla relevanta tids- och längdskalor. Det bör noteras att den rumsliga upplösning som kan uppnås i optisk mikroskopi bestäms av diffraktionsgränsen, som beror på våglängden hos målets och objektbelysningskällans våglängd45. För de system som finns till hands är den optiska upplösningsgränsen vanligtvis 200 nm. Dessutom kan intravital mikroskopi användas för att avbilda på subcellulär nivå46. För de nanopartiklar och proteinstabiliserade mikrobubblor som används i detta arbete är den minsta längdskala som är relevant för intravital mikroskopi storleken på små kapillärer (≥10 μm). In vitro höghastighets optisk avbildning (10 miljoner bilder per sekund) och höghastighetsfluorescensavbildning (500 000 bilder per sekund) experiment beskrivs för enstaka mikrobubblor. Höghastighets ljusfältsavbildning vid nanosekunders tidsskalor är lämplig för att studera den tidsupplösta radiella dynamiken hos de vibrerande bubblorna. Höghastighetsfluorescensmikroskopi möjliggör däremot direkt visualisering av frisättningen av de fluorescerande märkta nanopartiklarna. Dessutom kan mikrobubbleskalets struktur undersökas med hjälp av Z-stack tredimensionell (3D) konfokal mikroskopi och scanningelektronmikroskopi (protokollet för den senare ingår inte i det aktuella arbetet). Intravital mikroskopi består i att använda multifoton mikroskopi för att avbilda tumörer som växer i dorsala fönsterkammare för att ge realtidsinformation om lokalt blodflöde och om ödet för fluorescerande märkta nanopartiklar i vivo47. Kombinationen av dessa mikroskopi metoder ger i slutändan detaljerad inblick i beteendet hos terapeutiska microbubble agenter som svar på ultraljud, både in vitro och in vivo.
Olika optiska mikroskopimetoder kombinerades för att få information om de olika stegen i leveransen av nanopartiklar från ytan av mikrobubblor till det omgivande mediet. Imaging av bubbla svängningar utfördes, liksom imaging av frisättningen av nanopartiklarna från bubbla skal, extravasation och penetration genom extracellular matrisen av tumörer in vivo. In vitro-avbildning möjliggör screening av många ultraljudsparametrar jämfört med de mer komplexa in vivo-installationerna . Fördelen med att kombinera detta utbud av bildframställning modaliteter är den kompletterande information som kan erhållas på olika tidsskalor – en funktion som är avgörande för att karakterisera och optimera mikrobubblorna för framgångsrik leverans och för att erhålla terapeutisk effekt. Detta tillvägagångssätt är användbart för att förstå leveransmekanismerna för alla mikrobubblor, inklusive konstruktioner med fluorescerande märkta nanopartiklar och droger.
De mest kritiska stegen i mikroskopimetoderna som används för att studera enskilda mikrobubblor är följande. För fluorescensmikroskopi bör nanopartiklarna märkas fluorescerande för att möjliggöra visualisering av partikelutsläppet. Dessutom bör provlösningen spädas ut tillräckligt för att isolera enstaka mikrobubblor för analys i konfokala, ljusa fält och fluorescensmikroskopimetoder. Dessutom är det viktigt att välja en ultraljudskörningsfrekvens och akustiskt tryck för att excitera bubblorna mest effektivt, nämligen vid deras resonans. Om forskningsfrågan gäller leverans av nanopartikel nyttolasten, bör lämpliga ultraljudsparametrar vara en del av undersökningen. Förutom resonans bör dessa bubblor också drivas vid eller över tröskelvärdet för nanopartikelfrisättning, vanligtvis vid relativt höga akustiska tryckamplituder (MI > 0,3)51. För ljusfältsmikroskopiavbildning är det viktigt att välja en höghastighetskamera med en tillräckligt hög bildhastighet för att minimera rörelseoskärpa och undvika aliasing.
Ljusfältsmikroskopi begränsas huvudsakligen av bildbildsbildsbildhastigheten och intensiteten hos tillgängliga ljuskällor, eftersom en högre framerate skulle ge en mer detaljerad tidsupplöst inblick i bubbeldynamiken, men kräver mer intensiv belysning på grund av kortare exponeringstider. För att studera partikelutsläpp mer i detalj kan ramhastigheten för fluorescensavbildning i princip ökas genom att öka laserljusets intensitet. Absorptionen av det högintensiva laserljuset av de fluorescerande märkta mikrobubblorna genererar dock värme, även med färgämnen med hög kvantutbyte. Denna värme kan störa de experiment som står på spel, och i extrema fall inducera foto-termisk kavitation52. Således finns det i praktiken en gräns för den applicerade laserfluensen. Men intensiv laserbelysning kan också avsiktligt användas för att inducera partikelutsläpp från liposomer53. Temperaturen påverkar bubbeldynamik och ultraljudsrespons, beroende på bubbeltyp54. Om in vitro- och intravitala metoder ska jämföras objektivt bör därför de in vitro-metoder som diskuteras i protokollet utföras vid 37 °C. En annan begränsning av de in vitro-metoder som diskuteras i det aktuella papperet är att bubblorna inte är i en frifältsmiljö, eftersom mikrobubblor kommer att flyta under provhållarmembranet. Dessutom finns det en urvalsförskjutning när du avbildar enstaka mikrobubblor. Att utföra upprepade experiment på enskilda bubblor gör det dock möjligt att undersöka effekten av storlek och avlägsnande av den förvirrande faktorn – storleksfördelningen. Om bubbelresponsen som en funktion av storlek kan förstås medan koncentrationen inte är för hög för att förhindra bubbelbubblainteraktioner, kan svaret från någon godtycklig bubbelpopulation beräknas. Slutligen ger både ljusfälts- och fluorescensmikroskopimetoder insikt i mikrobubblor invecklade i en tvådimensionell (2D) bild. Om forskningsfrågan kräver mer än 2D-avbildning kan bubblornas 3D-beteende lösas genom att kombinera installationen som beskrivs i protokollet med en sidovyinställning för multiplansavbildning55.
En alternativ metod för att studera mikrobubblor är akustisk karakterisering56. Att mäta ekot från en enda mikrobubble kräver dock att man lokaliserar och isolerar en enda mikrobubble i ultraljudsstrålen56, vilket utgör en utmaning som vanligtvis hanteras genom användning av ett smalt rör eller optiska eller akustiska pincett57,58. För att storleksanpassa bubblor akustiskt kan mikrobubblorna insonifieras i den geometriska spridningsregimen vid frekvenser som är mycket högre än deras resonansfrekvens, vilket inte inducerar volymetriska mikrobubble svängningar59. Användningen av en “akustisk kamera” är en sådan metod för att avbilda den radiella dynamiken hos enstaka mikrobubblor som svar på ultraljud, där en högfrekvent ultraljudssond används för att bestämma bubblans radiella svar på en lågfrekvent körvåg60. Nackdelen med denna metod är att den endast kan användas för att bestämma den relativa förändringen av mikrobubbleradien. Därför behövs en annan metod för att bestämma den absoluta bubbelradien, t.ex. genom optisk avbildning61,62. Nackdelen med metoder där mikrobubblor utsätts för ultraljud vid frekvenser högre än deras resonansfrekvens är att vid så höga frekvenser minskar penetrationsdjupet59, vilket begränsar användbarheten för in vivo-applikationer. Andra former av mikroskopi kan också användas för att studera mikrobubblor som scanningelektronmikroskopi, atomkraftmikroskopi och transmissionselektronmikroskopi63. Den uppnåeliga spatio-temporal upplösningen av dessa alternativa mikroskopi tekniker är dock i allmänhet mer begränsad, och dessa tekniker har nackdelen att imaging utförs antingen före eller efter ultraljud exponering genom off-line analys och vanligtvis presenterar en låg genomströmning63. Ett annat alternativ är att använda en ljusspridningsmetod, som kan användas för att studera radiell dynamik hos enskilda mikrobubblor i realtid, men har ett lågt signal-brusförhållande jämfört med akustiska spridningsmetoder64.
Intravital mikroskopi i realtid under ultraljudsexponering är en kraftfull metod för att få ny insikt om vaskulaturen, beteendet hos mikrobubblor, nanopartiklar eller andra molekyler (såsom dextran i detta fall) under ultraljudsexponering. En allmän begränsning när man utför intravital mikroskopi i realtid är att endast ett litet område av vävnaden avbildas, och ljusets penetrationsdjup i vävnaden är begränsat. Om de avbildade kärlen innehåller mycket få mikrobubblor och/eller nanopartiklar inom synfältet kan lite eller ingen information om nanopartiklarnas beteende och extravasation erhållas. Dessutom, på grund av det begränsade synfältet, är en korrekt justering mellan ljus- och ultraljudsvägarna avgörande. Om ultraljudstrycket är tillräckligt högt för att inducera bubbeldestruktion är det också viktigt att välja en pulsrepetitionsfrekvens som gör att färska bubblor kan reperfusera in i synfältet mellan ultraljudspulser. Dessutom, eftersom ultraljudet kommer att reflekteras från täckglaset i fönsterkammaren och målet, är det viktigt att placera givaren i en vinkel för att minska reflektioner för att förhindra bildandet av stående vågor, vilket förvränger det kalibrerade tryckfältet. En annan praktisk fråga är att installationen måste ha tillräckligt med utrymme för att montera ultraljudsgivaren och vågledaren över eller under målet i mikroskopinställningen. Tumörerna i dorsala fönsterkammaren kommer att ha en begränsad tjocklek på grund av den begränsande kammaren och täckslipen; Om det behövs kan dock andra modeller användas. Exempel är hudveckstumörer, till exempel i bröstfett pad65 eller buken intravital avbildning av tumörer i de olika organen66. Sådana tumörer kan odlas orthotopically i lämplig mikromiljön, och som sådan, presentera ett mer kliniskt relevant fall.
De metoder som beskrivs i detta arbete upplysa potentialen hos fluorescerande märkta mikrobubblor att studera grunderna för läkemedelsleveransapplikationer med hjälp av bubblor och ultraljud. Denna kombination av mikroskopi metoder ger värdefull inblick i microbubble svar på ultraljud insonation och dess tillhörande akustiska parameter utrymme och presenterar en tydlig bild av microbubble och nyttolast beteende över ett relevant intervall av tid och längd skalor.
The authors have nothing to disclose.
100 MS/s Dual-Channel Arbitrary Waveform Generator model 8026 | Tabor Electronics | Arbitrary waveform generator (programmable) | |
2100 L | ENI | Amplifier, used in window chamber setup | |
2 MDa dextran | Sigma-Aldrich | ||
33522 A | Agilent Technologies | Arbitrary wave form generator, used in window chamber setup | |
A1R | Nikon Instruments | Confocal microscope | |
ACE I | SCHOTT | Dimmable AC halogen light source | |
Atipemazol | Orion Pharma | Antidote to wake animal | |
Baytril | Bayer | Enrofloxacin | |
BD Neoflon 24 G | Becton Dickinson & Company | Tail vein catheter | |
BNC model 575 | Berkely Nucleonics Corporation | Pulse/delay generator | |
Branson 2510 Ultrasonic Cleaner | Branson | Ultrasonic bath | |
Channel slide | Ibidi | ||
CLINIcell 25 | Laboratoires Mabio International | Cell culture casette (volume 10 mL, membrane area 25 cm2, membrane thickness 175 µm) | |
Cohlibri | Lightline | Laser (5 W, excitation wavelength 532 nm) | |
DP03014 Digital Phosphor Oscilloscope | Tektronix | Oscilloscope | |
Fentanyl | Actavis Group HF | Anaesthesia of mouse | |
Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | Supplement for cell culture medium | |
Fiber-optic hydrophone | Precision Acoustics | Used for alignment | |
Flumanezil | Fresenius Kabi | Antidote to wake animal | |
Heated animal holder | Custom design | A steel holder where the mouse is positioned on its side in a cavity fitting the size of a mouse, with the window chamber lying flat and immobilized with screws on each side. Below the chamber there is a hole in the holder to secure acoustic contact between the transducer and the skin. The holder is heated to a maximum temperature of 37°C, and the temperature is controlled by feedback from a rectal temperature probe in the mouse. The holder is mounted to an XY positioning stage so the animal can be moved independently to image different areas of the window chamber | |
Hyper Vision HPV-X2 | Shimadzu | High-speed camera | |
ImageJ | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin | open source image processing program | |
In vivo SliceScope | Scientifica | Multiphoton microscope | |
Isoflurane | Baxter | ||
ISOTON | Beckman Coulter | Filtered, phosphate-buffered saline solution | |
LUMPLFLN60XW | Olympus | Water immersion objective (magnification 60x, working distance 2 mm) | |
MaiTai DeepSee | Spectra-Physics | Pulsed laser | |
MATLAB | Mathworks | Programming environment | |
Medetomidine | Orion Pharma | Anesthesia of mouse | |
Midazolam | Accord Healthcare Limited | Anesthesia of mouse | |
Milli-Q | Merck | Ultrapure water | |
MVS 7010 High Intensity Xenon Strobe | PerkinElmer | Strobe light | |
Panametrics-NDT C305 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1", diameter 1") | |
Panametrics-NDT V304 | Olympus | Single-element focused immersion transducer (center frequency 2.25 MHz, focal distance 1.88", diameter 1.25") | |
Penicillin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
Perfluoropropane gas | F2 Chemicals | ||
Roswell Park Memorial Institute 1640 | Gibco Thermo-Fisher | Cell culture medium | |
Safe-Lock tube | Eppendorf | ||
Streptomycin | Sigma-Aldrich | Addition to cell culture medium before implantation of tumor in animals | |
T 25 basic ULTRA-TURRAX | IKA laboratory technology | Dispersion tool | |
TDS 210 | Tektronix | Oscilloscope, used in window chamber setup | |
Transducer | Precision Acoustics Ltd | Used in window chamber setup | |
U-TLU | Olympus | Tube lens | |
VBA100-200 | Vectawave | Amplifier | |
Window chambers | Custom made | Used in window chamber setup | |
XLUMPLFLN20 XW | Olympus | 20x water dipping objective | |
XY(Z) translation stages | Thorlabs |