MERK: Denne protokollen er spesifikk for håndtering av Aedes aegypti , men kan endres for å være effektiv for andre myggarter. 1. Produksjon og vedlikehold av en Aedes aegypti-koloni Bakre voksen Aedes aegypti og produsere egg.Forbered en 0,6 m x 0,6 m x 0,6 m sammenleggbar aluminiumsramme, stort oppdrettsbur med 20 x 20 glassfibernetting og en reach-in stockinette hylse på en vertikal vegg. Plasser et 1900 ml plastkar med Aedes aegypti-pupper (1: 1 kjønnsforhold) i hvert oppdrettsbur, bind hylsen lukket og la kopper være på plass for eclosion til det ikke kommer flere voksne (dvs. ca. 4 dager). På dette tidspunktet fjerner du koppene og opprettholder de voksne oppdrettsburene ved 28-30 ° C, >50% relativ fuktighet (Rh) og en 12: 12 eller 14: 10 lys: mørk (L: D) syklus.MERK: Produksjon av Aedes aegypti pupper er beskrevet i avsnitt 1.2. Tettheten av pupper i 1900 ml karet skal være slik at det er nok plass til at alle pupper kommer opp for luft samtidig. Tjuefire timer etter at puppene er plassert i oppdrettsburene, plasser en beholder med 10% sukroseløsning med en svampveke, og suspender en 10 cm x 2 cm svamp gjennomvåt i honning fra en trådkrok i hvert bur for å gi separate kilder til hydrering og ernæring til voksne mygg. Overvåk svampene og sukrosebeholderen for tørrhet eller muggvekst, og fyll på eller bytt etter behov.MERK: Bruk en 120 ml plastkopp med en 10 cm x 2 cm svampveke montert gjennom en utskjæring i lokket i små oppdrettsbur og en 460 ml plastkopp med en 12 cm x 8 cm svampveke i store bur. Gi et blodmåltid til hvert oppdrettsbur 48-72 timer etter at flertallet av voksne har dukket opp og hver 2-3 dager deretter for å opprettholde et høyt antall blodfødte kvinner for å maksimere eggutbyttet. Fyll et lammeskinnskondom med 50-100 ml defibrinert storfeblod, og varm opp til ca. 37 °C i et varmtvannsbad. Bruk deretter en klut eller et papirhåndkle til å klappe ned og delvis tørke kondomet før du legger det på en papirforet petriskål inne i buret i 30-60 minutter.MERK: Før bruk, skyll innsiden og utsiden av hvert kondom med vann 2-3x for å fjerne smøremidler eller andre underlag, og se etter hull. Kondomer kan gjenbrukes til 3-5 matinger ved å skylle ut blodet og lagre dem i en kopp kaldt vann. Som noen kolonier kan oppleve maurangrep, kan kondomer må suspenderes for å begrense tilgangen. Vent 48-72 timer etter hver blodmating, og introduser deretter en oviposisjonskopp i hvert voksenoppdrettsbur. Forbered oviposisjonskoppene ved å tilsette 200 ml filtrert puppetvann (dvs. vannlarvene og puppene ble oppdrettet i) i en plastkopp på 460 ml utstyrt med et 8-10 cm høyt x 30 cm bredt ark med frøspiringspapir (oviposisjonspapir) montert flush langs koppens indre omkrets. Kontroller oviposisjonspapirene daglig, bytt dem ut hver 2-4 dag, og oppbevar de eggbelastede oviposisjonspapirene nøye ved å la dem tørke i 24-48 timer ved >50% Rh19.MERK: La oviposisjonskoppene stå i oppdrettsburene i ikke mer enn 72 timer for å forhindre at eggene klekkes. Oppretthold de voksne oppdrettsburene i opptil 3-4 uker før du bryter dem ned og setter opp nye oppdrettsbur for voksne.For å bryte ned et oppdrettsbur, fjern og rengjør oviposisjonskoppen, oppbevar det eggbelastede oviposisjonspapiret, fjern og rengjør sukroseløsningsbeholderen og honningsvampen, og frys buret for å drepe alle mygg. Fjern alle mygglegemer, og rengjør innsiden og utsiden av hvert bur grundig med fortynnet såpe og vann ved hjelp av papirhåndklær og skureputer med svamper. La det rene buret tørke i minst 24 timer før du bruker det i neste oppdrettssyklus.MERK: Bruk vakuumutstyr utstyrt med høyeffektiv filtrering for å fjerne partikler som kan føre til allergi. Sukroseløsningsbeholdere kan rengjøres og gjenbrukes 3-5x. Oppdrett av Aedes aegypti larver fra eggForbered et lager av larve ernæringsmessig oppslemming ved å blande 80 g av et 3: 2-forhold av storfeleverpulver: bryggergær i 2200 ml vann fra springen. Tilbered pulverisert fiskemat. Hell fiskeflak i en krydderkvern og slip til det er et fint pulver.MERK: Denne slammet er betegnet som brunt i dette laboratoriet . Bruk eggbelastet (5.000-10.000 egg) oviposisjonspapir fra trinn 1.1.5, kutt en 3-7 cm del av eggpapiret vinkelrett på oviposisjonslinjen, og legg det i en 460 ml beholder halvfylt med vann fra springen sammen med en klype pulveriserte fiskematflak. Dekk til og agiter kraftig i minst 1 min.MERK: Eggpapir må oppbevares i minst 7 dager (men ikke mer enn 90 dager, noe som kan redusere klekking) etter oviposisjon før klekkingsprosessen påbegynnes for å tillate embryonasjon. Bakterier og alger som er tilstede i fiskematen, deoksygenerer raskt vannet, noe som utløser larveutvikling. Hell hele innholdet i beholderen fra trinn 1.2.2 i en larveoppdrettspanne tilberedt med 3 liter vann fra springen og 50 ml brun slam. Merk pannen med startdato, belastningsinformasjon, fôringsplan per tabell 1, og oppbevar ved 28-30 °C, >50 % Rh og 12:12 eller 14:10 L:D sykkel.MERK: 3 liter vann til 50 ml brunt forhold er basert på vanndybden i de spesielle larvepannene som er nevnt i materialtabellen. Panner i forskjellige størrelser vil støtte forskjellige puppetettheter og dermed kreve forskjellige mengder vann og brun slam. Larvefôringsrater i tabell 1 er angitt som et område; valg av mengden som brukes er basert på erfaring og bestemmelse av den generelle helsen til de utviklende larver ved hjelp av variabler som vannturbiditet, farge og lukt; Tilstedeværelse av bakteriell film på vannet; antall eller forhold mellom levende og døde larver; og larvers motilitet. På dag 3 til 6 pulveriserte fôr umodne mygg fiskemat i henhold til tabell 1. Å tilsette vann, redusere mat og sette opp 2-3 ekstra panner enn prosjektet krever, er måter å håndtere usunne larvepanner på. Dag Volum ernæringsmessig slurry tilsatt Volum vann tilsatt Handlinger 1 50 ml (slam) 3000 ml 2 (ingen mat) (ingen vann) 3 1/4 – 1/2 ts (pulverisert fiskemat) 500-1000 ml 4 1/2 – 3/4 ts (pulverisert fiskemat) 500-1000 ml 5 1/2 – 3/4 ts (pulverisert fiskemat) 500-1000 ml 6 1/4 – 1/2 ts (pulverisert fiskemat) 500-1000 ml 7 (ingen mat) (ingen vann) stammepupper og larver Tabell 1: Fôringsplan for masseoppdrett av Aedes aegypti larver. 2. Separasjon av mannlige Aedes aegypti pupper Konsentrat pupper fra larvepannene. Når den omtrentlige terskelandelen av pupper er nådd, hell innholdet i hver panne gjennom en sigte (størrelse 20-40). Bruk en klemmeflaske vann fra springen til å vaske puppene og larvene ut av silen til et 3000 ml gradert plastbeger.MERK: Bare 2-3 larvepanner skal overføres til hvert 3000 ml beger for å unngå overbefolkning slik at pupper kan nå overflaten komfortabelt. Puppene forventes å utvikle seg mellom 130-140 timer etter eggeyngling under temperatur- og lysforholdene nevnt i trinn 1.2.3. Forvent merkbar eggeluke samme dag som eggene settes opp. Avhengig av miljøforholdene vil ca 20-70% av larvene ha forpuppet seg og være klare til å bli siktet innen 6 dager. Partisjonering av puppene over flere 3000 ml beger sikrer håndterbare volumer å helle i separatoren. Separat mannlige pupper fra larver og kvinnelige pupper.MERK: Dette trinnet kan utføres av én operatør eller to operatorer.For en enkelt operatør som skiller hannpupper:Del opp innholdet i hvert 3000 ml beger som genereres i trinn 2.1, i flere 1900 ml plastbeholdere for å redusere søl og overbelaste separatoren. Forbered plateseparatoren ved å plassere en stiv, grunn, 4000 ml oppsamlingsbeholder under slusen ved bunnen av separatoren (figur 1). Fyll to 3000 ml graderte plastbeger ca 3/4 fulle av vann fra springen.MERK: Bruk en vaskeslange som et alternativ til 3000 ml plastgraderte beger. Ellers må beger kontinuerlig etterfylles gjennom separasjonsprosessen. Ytterligere detaljer for bruk av puppeseparatoren finner du i referanser 12,20. Hell vann gjennom rommet mellom glassplatene og juster topp- og bunnknappene med eller mot klokken for å la vann kontinuerlig strømme gjennom samtidig som det genererer stående vann til en høyde på ca. 1,25 cm fra bunnen av platene. Merk startposisjonene til bunnknappene med tape. Når stående vann er jevnt fordelt over bunnen av glassplatene med samme høyde og dreneringshastighet, begynner du å helle innholdet i beholderne med pupper og larver gjennom rommet mellom platene.MERK: En klar separasjon bør være tilstede mellom små (mannlige) og store (kvinnelige) pupper; Ellers skyll denne batchen gjennom, og juster de øvre knappene for å redusere avstanden mellom platene. Mens du sakte heller vann gjennom separatoren, roterer du kontinuerlig de nederste knottene som et par mot klokken ~ 1-2 cm fra tapemerket startposisjon til de fleste eller alle larver har vasket gjennom og sklidd ned slusen i oppsamlingsbeholderen.MERK: Når den ene hånden brukes til å helle vann, roterer den andre hånden knottene en om gangen, men like og i små trinn, for sakte å åpne platene. De fleste larver vaskes raskt gjennom, men det vil bli fanget noen larver med hannpuppene. Disse stragglerlarvene vil bli bestrålt, men vil henge etter i utvikling og ikke eclose til voksne med fokalkohorten av pupper. Kast eller resirkuler larvene tilbake i kolonien, men fjern dem i begge tilfeller fra oppsamlingsbeholderen før hannpuppene begynner å vaske gjennom separatoren. Pause prosessen ved å stoppe vannstrømmen mens oppsamlingsbeholderen ved foten av sluse blir ryddet av larver ved å helle gjennom en # 30 sil, som er tilbakevasket i en separat beholder.MERK: Larvene strømmer gjennom først, etterfulgt av hannpupper, og til slutt hunnene (figur 1). Fortsett å helle vann og roter bunnknappene til hannlarvene vaskes gjennom og separeres i oppsamlingsbeholderen. Sett prosessen på pause for å se etter og fjerne larver fra oppsamlingsbeholderen før overføring av hannpuppene i neste trinn.MERK: Antall spylinger som trengs for å skille hannene, avhenger av tempoet på vannhellingen og hastigheten som knottene roteres med. Det tar vanligvis 2000-2500 ml vann å skylle larvene ut, 1000-1500 ml for å skylle ut hannpuppene, og 200-400 ml for å skylle ut hunnpuppene. Hell hannpuppene ut av oppsamlingsbeholderen gjennom en #20-sil over en vask. Bruk en 1000 ml klemmeflaske med vann fra springen til å vaske hannpuppene fra silen mens du heller i en separat 1900 ml beholder. Når alle hannpuppene er separert, fortsett å helle vann gjennom separatoren, og juster de nedre knottene for å skylle gjennom hunnpuppene. Overfør hunnene ved hjelp av silprosessen beskrevet i trinn 2.2.1.6 i en separat beholder til alle umodne mygg er skyllet ut av separatoren. Kast de kvinnelige puppene. Når batchen er behandlet, returnerer du knottene til de opprinnelige startposisjonene, og gjentar prosessen med neste batch. Når alle partiene er behandlet, la platene stå åpne slik at separatoren kan tørke.MERK: Det er ingen perfekt separasjon ved hjelp av denne enheten, noe som krever tålmodighet og øvelse. Sta pupper eller larver kan løsnes med en tung strøm av vann, men ikke i den grad at det skyver dem til sidene, noe som kan forurense fremtidige oversvømmelser. For to operatorer som skiller hannpuppene, endrer du avsnitt 2.2.1 som følger.Første operatør: Hell vann gjennom separatoren, og roter knottene trinnvis for å skille larver, hannpupper og hunnpupper. Andre operatør: Når hvert trinn er samlet inn i slusebeholderen, sil ut innholdet i slusebeholderen for å dele larver, hannpupper og kvinnelige pupper i flere, separate sluseoppsamlingsbeholdere. Hold de store begerglassene fylt med vann hvis en vaskeslange ikke er tilgjengelig. Figur 1: Pupal separator som inneholder et parti umoden Aedes aegypti. Separasjon begynner med å helle vann gjennom separatoren mens du roterer de nederste knottene 1-2 cm mot klokken til det målrettede settet, dvs. larver, hannpupper eller kvinnelige pupper, har blitt isolert så mye som mulig fra settene som gjenstår (venstre bilde). Høyre bilde viser separasjon av larver (laveste bånd), hannpupper (midtbånd) og hunnpupper (øvre bånd). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 3. Fremstilling av mannlige Aedes aegypti pupper for bestråling Del hannpuppene i 60 mm petriskåler av plast.MERK: Antall petriskåler som trengs, avhenger av hvor mange hannpupper som er tilgjengelige for bestråling: en larveoppdrettspanne fra trinn 1.2 vil fylle omtrent 1,5 petriskåler. Alderen på puppene varierer fra 1 til 40 timer gammel. I denne protokollen kalles den mindre diameteren dypere halvdel av petriskålen bunnen, og den grunnere halvdelen med større diameter kalles toppen.Forbered forhåndskuttede disker av filterpapir for å passe til den indre diameteren på petriskålbunnen. Plasser en vannfuktet filterpapirskive i hver av bunnene på petriskålene for å holde puppene hydrert gjennom transport og bestrålingsprosessen. Overfør puppene til petriskåler. Sil hannpuppene samlet i trinn 2.2.1.6 med en sil og vask puppene til et 1000 ml gradert beger med så lite vann som mulig. Hell puppene forsiktig i petriskåler til hver filterpapirskive er jevnt dekket med et enkelt lag med pupper (figur 2A – C). Ordne petriskålene på kanten av et bord på rad for å lette hellingen.MERK: Et alternativ til å sile puppene er å klippe tuppen av en plastpipette på 3 ml Pasteur til en diameter som er stor nok til å romme puppene. Bruk pipetten til å overføre puppene fra beholderen produsert i trinn 2.2.1.6 direkte til filterpapirdiskene, slik at det er et enkelt, tettpakket lag med pupper i hver petriskål. Dette er bare praktisk for små batcher. Bruk en uendret 3 ml Pasteur-pipette for å fjerne stående vann fra petriskålbunnen for å forhindre puppebevegelse under sexingtrinnet (3.2) og transport. Figur 2: Overføring av pupper til petriskåler for bestråling. (A) Siktede pupper helles og tilbakevaskes i et 1000 ml plastbeger. (B) Minimalt med vann holdes i begeret for å lette hellingen i petriskåler. (C) Petriskåler stilt opp langs kanten av en overflate for å lette helling i et enkelt lag med pupper. (D) Petri-retter lastet med pupper stables og sikres for levering til bestrålingsanlegget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Sex puppene for å se etter forurensning med kvinner. Under et dissekeringsomfang, bruk sonder for å rotere hver puppe for å sjekke ventraloverflaten for en stor størrelse genital lobe (figur 3) som indikerer mannlig kjønn. Fjern og kast puppene med reduserte eller små kjønnslapper som indikerer hunner og erstatt med like mange hannpupper for å opprettholde riktig telling.MERK: I et operativt program er dette trinnet ikke praktisk på grunn av et stort antall mygg, og det faktum at separasjon, overføring, bestråling og forberedelse av bur etter bestråling gjøres på en dag med begrenset tid. Kvalitetskontroll av en prøve fra utvalgte petriskåler kan gjøres, spesielt i tidlige faser av utviklingen av SIT-programmet. Figur 3: Kjønnspupper med underlappen . (A) Ventrale og (B) laterale syn på kvinnelige () og mannlige (♀ ♂) Aedes aegypti pupper, med kjønnslapper indikert for å vise seksuell dimorfisme. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Dekk bunnene med toppen av petriskålene, og fest med laboratorietape. Pakk de teipede petriskålene med elastiske bånd i stabler som passer i bestrålingskammeret, og forsegl inne i en merket 3,8 L gjenlukkbar pose (figur 2D). Ikke la pupper forbli avdekket i >1 time. 4. Bestråling av mannlige Aedes aegypti pupper Forbered dosimetrifilm fra samme parti ved å kutte 1 cm2 firkanter av filmer og plassere hver firkant i sin individuelle konvolutt.MERK: All film som brukes på hver dag er kuttet på samme tid. Dette reduserer den lille variasjonen som induseres av lagring. Antall firkanter som trengs for hver stabel er 1 + (antall petriskåler). Forbered et sett som skal tas inn i bestrålingsanlegget, som skal inneholde en laboratorietimer, laboratoriebånd, permanent markør, forberedte konvolutter med dosimetrifilm, dosimetrimerke og et laboratorienotatark med sjekklister for å holde oversikt over nøkkelinformasjon (figur 4). Figur 4: Laboratoriebok disposisjon-IR-ark fullført for et doseresponssett. Tekstbokser skissert i rødt (merket med røde piler) indikerer nyttige notater om de forskjellige seksjonene og gjentar nøkkelinformasjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Transport puppene til bestrålingsanlegget. Plasser petriskålene til hannpupper fra trinn 3.3 i isolerte beholdere og oppbevar uten direkte sollys og med klimaanlegg under transport. Forbered stabler med petriskåler for bestråling ved bestråleren. Stable riktig antall petriskåler som passer i bestrålingskammeret med en dosimetrifilmkonvolutt sentrert mellom hver tallerken og øverst og nederst i stabelen. Fest konvoluttene og hele stabelen med laboratorietape for å forhindre søl og forenkle plassering av stabelen i kammeret. Bestråle petriskålene til mannlige pupper. Plasser bunken med petriskåler på det stive metallnettet i kammeret for å plassere i riktig høyde for optimal eksponeringskjegle basert på tidligere dosekartlegging av den spesifikke bestrålingsenheten21. Aktiver platespilleren på bestråleren og bestråle, samtidig som du starter laboratorietimeren. Bestråle for riktig intervall for å oppnå ønsket dose (eksempler er vist i tabell 2).MERK: Denne protokollen er basert på en cesium-137 bestråler (se materialtabellen) og en måldose på 50 Gy. Fordi Cs-137 henfaller over tid, justeres dosehastigheten hvert år ved å utføre en dose-respons-serie ved bruk av alanindosimetre, supplert med radiokromisk film for rutinemessig dosimetri og alanin i omtrent 10% av bestrålte prøver. Gitt den nåværende dosehastigheten på 8,8 Gy/min, krever det 5 min, 41 s eksponering for å oppnå måldosen på 50 minutter, 41 s. Rutinemessig filmdosimetri forekommer som beskrevet i trinn 4.7. Alanin pelletsdosimetri utføres enten ved National Center for Electron Beam Research ved Texas A&M University eller ved National Institute of Standards and Technology i Gaithersburg, MD, USA. Dosering (Gy) Tid (basert på 8,8 Gy/min) 0 NA 10 1 min 8 s 30 3 min 24 s 50 5 min 41 s 65 7 min 23 s 85 9 min 39 s 100 11 min 22 s 110 12 min 30 s Tabell 2: Eksempel doseringstider for Cesium-137 bestråler. Når den foreskrevne tiden er gått, fjern petriskålene fra bestråleren og demonter stabelen forsiktig. Merk alle petriskålene og filmkonvoluttene med dato og sted i bunken. Forsegl konvoluttene og oppbevar for dosimetri. Pakk petriskålene om i den isolerte beholderen for transport tilbake til hovedlaboratoriet.MERK: Registrer om voksne dukket opp under bestråling og merk den berørte petriskålen slik at de voksne ikke slipper ut når puppene settes inn i oppdrettsburene (trinn 5.2). Bekreft bestrålingsdosen med dosimetrifilm ved å måle filmen ca. 24 timer etter eksponering. Aktiver dosimetrileseren og la den balansere til romtemperatur. Legg filmen med tang som følger med leseren, og følg produsentens instruksjoner for å lese den bestrålte filmen samt den bestrålte blanke filmen fra samme batch. Null leseren uten film mellom avlesningene, og registrer data som i eksempeldatabladet vist i figur 5.MERK: Denne protokollen er basert på standardene ND0.5 og ND1.0 QA Filter Set. Det er viktig å måle filmen med den matte siden vendt mot operatøren. Figur 5: Dosimetri datablad fylt med eksempeldata. Kolonneoverskriftene ber operatøren om å registrere nøkkeldata for senere analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 5. Oppdrett av bestrålte mannlige Aedes aegypti pupper til voksne Rengjør og klargjør små plast 30 cm x 30 cm x 30 cm oppdrettsbur slik at de er klare for bestrålte pupper ved retur til hovedlaboratoriet. For hver 2 petriskåler av bestrålte hannpupper, tilbered 1 oppdrettsbur. Lager hvert oppdrettsbur med en halvfylt plastkopp som inneholder 460 ml vann fra springen og en 10% sukroseløsningsbeholder, som beskrevet i trinn 1.1.3. Overfør straks de bestrålte puppene til de forberedte oppdrettsburene etter retur fra bestrålingsanlegget. Bruk en klemmeflaske med vann til å vaske puppene fra hver petriskål forsiktig inn i 460 ml vann i plastkoppen i hvert oppdrettsbur. Etter 24 timer, overfør koppene til nye, rene oppdrettsbur som inneholder næringskilden, og vent på gjenværende eklose av voksen, mannlig bestrålt Aedes aegypti.MERK: Hvis det har oppstått pupper under bestrålingsprosessen, åpner du petriskålene med løpesedlene i et tomt bur, og fortsetter deretter med trinn 5.2. Kast mennene samlet i dette buret. Pupper overføres til nye oppdrettsbur etter 24 timer fordi hanner dukker opp før kvinner i samme kohort, og isolering av dagene med fremvekst kan redusere forekomsten av kvinnelig forurensning og sikre nøyaktig aldring av hanner. 6. Merking og veiing av bestrålte voksne Aedes aegypti-hanner MERK: Denne delen av protokollen forutsetter at to personer utfører oppgavene; for 1 person, se 6.4. Figur 6: Pakking merket, bestrålt, mannlig Aedes aegypti i utløsningsbeholdere. (A) Utløserbeholder som viser stockinette festet til et hull kuttet i siden av kartongsylinderen med maskeringstape, stifter og varmt lim. Rammen er på plass med en maskeringstapeetikett festet til siden. Rammen beholder det tett trukket tyllnettdekselet; Et elastisk bånd (ikke synlig) holder også tyllen på plass under rammen. (B) Batch av bedøvede hanner i ferd med å bli tumlet i rosa fargestoff i en liten kartongkopp. (C) Fire utløsercontainere inne i isolert fraktcontainer. Legg merke til at stockinette-ermene er orientert mot midten av fraktbeholderen, pakkematerialene er gjemt rundt utløserbeholderne, og ernærings- og hydreringskilder er på plass på toppen av hver utløserbeholder dekket av en omvendt petriskålbunn som holdes fast av kryssede elastiske bånd og biter av tape. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Forbered beholdere for frigjøring av kartonger.Klipp et hull på 11,5 cm i diameter på siden av en lokket, sylindrisk 3,9 L kartongbeholder på 1,5-3,0 cm fra bunnen slik at hullet ikke blir dekket av lokket (figur 6A). Skjær en 40-50 cm lengde på stockinette, og stift den ene enden av den rundt innsiden av 11,5 cm hullet kuttet i 6.1.1. Bruk en standard kontorstiftemaskin åpnet slik at stifter kan tvinges gjennom lageret og kartongen fra innsiden av beholderen og inn i en passende arbeidsflate, for eksempel en blokk med hardt ekstrudert polystyrenskum. Krympe stiftene ved hjelp av en flathodet skrutrekker for å feste lageret tett til omkretsen av hullet og fest maskeringstape over den krympede siden for å forhindre snags. Forsegl kanten av lageret på innsiden av sylinderen til kartongen med varmt lim og kryssjekk hele forsamlingen for rømningshull. Lag en festeramme ved å fjerne den indre disken fra lokket og kutte en 33 cm x 33 cm firkant av nylon tyll mesh fint nok til å beholde voksne mannlige Aedes aegypti mygg. Plasser nettet på den åpne enden av sylinderen og sett rammen over nettet for å holde den på plass uten hull. Trekk masken nedover slik at den stikker ut under rammen for å få nettet til å skinne over den åpne enden og forsegle det fremspringende nettet tett mot sylinderen med et gummibånd. Plasser et 10 cm stykke maskeringstape på siden av rammen dekket med et 8 cm stykke merkebånd slik at merkebåndet enkelt kan byttes ut uten å rive rammen.MERK: Utløserbeholdere er holdbare og kan gjenbrukes >10x med riktig håndtering. Før du introduserer hver ny gruppe merkede, bestrålte, voksne, mannlige mygg, må du kontrollere at lageret er forsvarlig festet til beholderen, og straks foreta reparasjoner om nødvendig. Forbered veie- og merkestasjonen.Hell ca. 50 mg merkefargestoff i en 240 ml kartongbeholder, og fordel fargestoffet som et lag pulver jevnt rundt beholderens indre overflater. Trykk forsiktig for å kaste overflødig fargestoff. Bruk tydelig merkede kopper for flere fargestoffer for å holde fargene skilt. Ta en 100-500 g veiebåt på en 0,0001 g elektronisk balanse; opprette et dataskjema (tabell 3); og tape sammen fire ark med 215,9 mm x 355,6 mm kopipapir for å lage en arbeidsflate på 431,8 mm x 711,2 mm. Slipp beholder Vekt av mygg Bur nummer Kvinner i batch Antall menn Slipp beholder Total masse ROSA I 0.024 D1 # 1 25 ROSA I 2.03 ROSA I 2.007 D1 # 1 7 ROSA II 1.99 ROSA II 1.990 D1 # 1 ROSA III 2.03 ROSA III 0.026 D1 # 3 25 ROSA III 2.000 D1 # 3 18 Tabell 3: Datatabell for veiestasjon. Merk kvantifiserte partier av voksne bestrålte hanner med fluorescerende pigment.Overfør voksne mygg (2,5-3,5 dager gamle) fra hvert oppdrettsbur til aspiratorflasker. Fjern næringskilder fra oppdrettsburet fra trinn 5.2 og legg hele buret i et stort CO2-kammer i 5-7 minutter, bank sidene av beholderen for å løsne mygg som kan klamre seg til oppdrettsburet. Etter at eksponeringstiden er gått, fjern oppdrettsburet fra kammeret, og aspirer alle de voksne myggene i en serie plast aspirasjonsflasker.MERK: Administrasjon av 99,5-100% CO2 er fra en tank med en regulator, messingstang og silikonrør kanalisert inn i kammeret med en strømningshastighet på 6 l / min. Antall hetteglass som trengs for å rydde oppdrettsburet, avhenger av hvor mange mygg som er i buret og operatørens ferdigheter, men 3-5 hetteglass er vanligvis nødvendig per bur. Velg en aspirator som har små hetteglass med hurtigbytte for å lette håndteringen av voksne mygg i grupper, for eksempel en som bruker et 60 ml polystyrenoppsamlingshetteglass forseglet med 20 x 20 mesh aluminiumsskjerm i den ene enden og en klar acetatklaffventil i den andre. Hele buret bedøves før aspirasjon for å redusere tiden for å overføre mygg til hetteglass for å redusere stresset på mygg og holde protokollen trekkbar. Sorter alle voksne mygg fra hvert oppdrettsbur etter kjønn.Utsett det første hetteglasset fra trinn 6.3.1 til CO 2 i et lite kammer i 4 minutter, og rist deretter de bedøvede myggene forsiktig ut og spre dem over arbeidsflaten på hvitt papir tilberedt i trinn 6.2.2. Legg et nytt tomt hetteglass inn i aspiratoren, og aspirer forsiktig alle hanner fra arbeidsflaten, og pass dette hetteglasset til veiestasjonen (trinn 6.3.3.). Tell eventuelle kvinner som er igjen, og aspirer dem i et eget hetteglass og kast, sammen med eventuelle knuste hanner. Gjenta denne prosessen med de resterende hetteglassene fra 6.3.1, men på et tidspunkt i kjønnssorteringsprosessen, generer et eget hetteglass med bare 25 hanner som også sendes til veiestasjonen. Gjenta trinn 6.3.2. for hvert oppdrettsbur.MERK: Mens du behandler bestrålte voksne menn for sexing, veiing og merking, hold oversikt over antall kvinner i hver batch, som er nøkkeldata for feilsøking og kvalitetssikring av puppesexsortering og hele prosessen. Hvis kvinnetallet er høyere enn forventet, bør en annen person trekke ut kvinner mens hovedoperatøren aspirerer hannene. Det er viktig å veie en prøve på 25 hanner fra hvert oppdrettsbur for å beregne en gjennomsnittlig vekt per mygg, som vil bli brukt til å estimere antall merkede bestrålte hanner som slippes ut på slutten av protokollen. Veie og fargelegge partier av voksne mannlige mygg.På veiestasjonen plasserer du det første hetteglasset med voksne hannmygg fra sexingstasjonen (pkt. 6.3.2) i et lite CO2-kammer i 2 minutter, og rister myggen forsiktig inn i den tjærede veiebåten som er tilberedt i trinn 6.2.2. Ta opp myggens vekt og hell myggene i fargekoppen tilberedt i 6.2.1. Vipp og roter koppen 1 sakte full rotasjon med klokken og mot klokken slik at myggene kommer i kontakt med pulverlakken på koppens indre overflater og er lett støvet med fargestoff (figur 6B). Hell de merkede myggene i en veiebåt. Fortsett raskt til neste trinn slik at myggene ikke gjenoppretter og unnslipper. Gjenta dette trinnet til alle hetteglassene fra pkt. 6.3.2 er behandlet.MERK: Vekten av hannene fra det separate hetteglasset med 25 hanner generert for hvert oppdrettsbur i pkt. 6.3.2 registreres og brukes til å beregne gjennomsnittsvekten per hann fra buret. Legg i utløserbeholderne med merkede bestrålte voksne hanner. Brett veiebåten som inneholder bedøvede, merkede, bestrålte, hannmygg litt fra slutten av seksjon 6.3.3. for å opprette en kanal, og deretter lede denne kanalen gjennom stockinette-hylsen for å overføre hannene til utløserbeholderen. Fortsett å legge til mygg til ca 2,0 g eller 1500-3000 mannlige mygg er i utløserbeholderen og bind stockinettehylsen lukket. Merk merkingsbåndet på rammen til utløserbeholderen med fargestofffarge, beholdernummer og total vekt av mygg, og kopier disse dataene til skjemaet fra trinn 6.2.2.MERK: Håndtering av mygg i alle livsfaser induserer stress og kan redusere overlevelse eller kraft. Serien av bedøvelsesmidler beskrevet i denne protokollen kan påvirke myggene; Imidlertid vil forsøk på å forfølge og aspirere ikke-bedøvede mygg på hvert trinn indusere større stress og en uholdbar protokoll. Del den totale vekten av mygg i hver utløsningsbeholder med gjennomsnittsvekten per mannlig mygg generert i avsnitt 6.3.3 for å utlede et estimat av antall hanner i den utløserbeholderen; Hver utløsningsbeholder skal ikke ha mer enn 2 g hanner, noe som tilsvarer ca. 1 stort oppdrettsbur. Endringer i merkeprotokollen for en enkelt operatørUtfør sexsortering for alle store bur først. Utsett hvert stort bur for CO2 i 4-5 min og aspirer alle myggene i 4-5 hetteglass. Utsett hvert hetteglass for CO 2 i2-3 min, tipp ut alle myggene på arbeidsflaten på hvitt papir, fjern hunnene og telleapparatet, og returner hannene til deres store populasjonsbur. Veiing og merkingStart med det første hannholderburet produsert i trinn 6.4.1: fjern næringskilden og bedøv hannene i et stort CO2-kammer i 5-7 min. Aspirer de bedøvede hannene jevnt i separate hetteglass. Gjenta dette trinnet med hvert holdebur i den rekkefølgen de ble produsert.MERK: Det vil bli produsert ca. 2-3 overfylte hetteglass per oppbevaringsbur. Behandling av hannholderbur i den rekkefølgen de ble produsert maksimerer restitusjonstiden for hvert bur av hanner. Bedøv det første hetteglasset produsert i trinn 6.4.2.1. i 1-2 min i et lite CO2-kammer . Hell ut et lite antall mygg på det hvite papirets arbeidsflate, aspirer 25 hannmygg i et nytt hetteglass, og behandle som i 6.3.2 for å bestemme gjennomsnittsvekten per hann for det buret. Returner eventuelle ekstra hanner til hetteglasset med kilden, eller aspirer til et nytt separat hetteglass som skal behandles senere; Fortsett med veiing, merking og overføring til beholderne for resten av hannene i det første hetteglasset som beskrevet i resten av trinn 6.3. Gjenta trinn 6.4.2.2. (bortsett fra isolering av 25 hanner i et separat hetteglass) for resten av hetteglassene produsert i trinn 6.4.2.1. i den rekkefølgen de ble produsert, og deretter gå videre til neste kjønnssorterte oppdrettsmerd produsert i 6.4.1.MERK: Arbeidsflyter med en person er tregere, og noen mannlige mygg må bedøves flere ganger. Søk kontinuerlig etter og fjern kvinnelige mygg. 7. Emballasje- og forsendelsesbeholdere med merket, bestrålt, voksen hann Aedes aegypti Forbered utgivelsesbeholderne for forsendelse. Når en utløserbeholder er fylt med markerte hanner, legg 4 bomullsballer fuktet med 10% sukroseløsning på maskelokket og dekk med en omvendt bunn av en petriskål holdt på plass av to gummibånd strukket rundt hele beholderen og over petriskålen for å danne et kors. Legg et stykke maskeringstape over X-en på de to gummibåndene for å holde dem på plass på toppen av den omvendte petriskålen.MERK: Forsikre deg om at bomullskulene med 10% sukroseoppløsning ikke er mettet til drypp, noe som vil skade beholderen og fange og drepe mygg. Pakk kartongbeholdere i en ekstrudert polystyrenskum som sender kjøler. Stikk 4 ventilasjonshull gjennom kjølelokket og okkluder med bomull for å holde maur ute og hold i rømte mygg. Plasser 4 utløsningsbeholdere oppreist i fraktkjøleren med lageret til hver container vendt mot midten (figur 6C). Tuck bobleplast mellom hver beholder og i midten for å stabilisere dem. Fyll ut resten av plassen i fraktkjøleren med luftputer eller stable et andre lag med 4 utløserbeholdere direkte på toppen av det første laget og stabiliser på samme måte med luftputer.MERK: Utløserbeholderne skal være tilstrekkelig stabilisert til ikke å bevege seg når de ristes. Temperaturen inne i pakken er omgivende. Forbered fraktkjøleren for levering. Forsegl fraktkjøleren med det ventilerte lokket, og sett i papppakningen, tape lukket og send via ekspress over natten til utløsningsstedet.