NOT: Bu protokol Aedes aegypti’nin işlenmesine özgüdür, ancak diğer sivrisinek türleri için etkili olacak şekilde değiştirilebilir. 1. Bir Aedes aegypti kolonisinin üretimi ve bakımı Arka yetişkin Aedes aegypti ve yumurta üretir.0,6 m x 0,6 m x 0,6 m katlanabilir, alüminyum çerçeve, 20 x 20 fiberglas örgü elemeli büyük yetiştirme kafesi ve bir dikey duvarda uzanma stoğu manşonu hazırlayın. Her yetiştirme kafesine Aedes aegypti pupa (1: 1 cinsiyet oranı) içeren 1900 mL’lik bir plastik küvet yerleştirin, manşonu kapalı bağlayın ve daha fazla yetişkin ortaya çıkmayana kadar (yani yaklaşık 4 gün) eclosion için bardakları yerinde bırakın. Bu zamanda, bardakları çıkarın ve yetişkin yetiştirme kafeslerini 28-30 ° C’de,% >50 bağıl nemde (Rh) ve 12: 12 veya 14: 10 açık: karanlık (L: D) döngüsünde tutun.NOT: Aedes aegypti pupalarının üretimi bölüm 1.2’de açıklanmıştır. 1900 mL küvetteki pupaların yoğunluğu, tüm pupaların aynı anda havaya çıkması için yeterli alan olacak şekilde olmalıdır. Pupa yetiştirme kafeslerine yerleştirildikten yirmi dört saat sonra, bir sünger fitili ile% 10 sakkaroz çözeltisinden oluşan bir kap yerleştirin ve yetişkin sivrisineklere ayrı hidrasyon ve beslenme kaynakları sağlamak için her kafesteki bir tel kancadan bala batırılmış 10 cm x 2 cm’lik bir süngeri askıya alın. Süngerleri ve sakkaroz kabını kuruluk veya küf büyümesi açısından izleyin ve gerektiğinde yenileyin veya değiştirin.NOT: Küçük yetiştirme kafeslerinde kapaktaki bir kesikten geçirilmiş 10 cm x 2 cm sünger fitilli 120 mL’lik bir plastik bardak ve büyük kafeslerde 12 cm x 8 cm sünger fitilli 460 mL plastik bardak kullanın. Yetişkinlerin çoğunluğu ortaya çıktıktan 48-72 saat sonra ve bundan sonra her 2-3 günde bir, yumurta verimini en üst düzeye çıkarmak için yüksek sayıda kanla beslenen dişi tutmak için her yetiştirme kafesine bir kan unu verin. Bir kuzu derisi prezervatifini 50-100 mL defibrinlenmiş sığır kanı ile doldurun ve sıcak su banyosunda yaklaşık 37 ° C’ye kadar ısıtın. Ardından, prezervatifi 30-60 dakika boyunca kafesin içindeki kağıt kaplı bir Petri kabına yerleştirmeden önce patlatmak ve kısmen kurutmak için bir bez veya kağıt havlu kullanın.NOT: Kullanmadan önce, yağlayıcıları veya diğer substratları çıkarmak için her prezervatifin içini ve dışını suyla 2-3x durulayın ve delikleri kontrol edin. Prezervatifler, kanı durulayarak ve bir bardak soğuk suda saklayarak 3-5 besleme için tekrar kullanılabilir. Bazı koloniler karınca istilası yaşayabileceğinden, erişimi sınırlamak için prezervatiflerin askıya alınması gerekebilir. Her kan beslemesinden sonra 48-72 saat bekleyin ve ardından her yetişkin yetiştirme kafesine bir yumurtlama kabı yerleştirin. Yumurtlama kaplarını, 200 mL filtrelenmiş pupa suyu (yani, su larvaları ve pupalar yetiştirildi) ekleyerek, bardağın iç çevresi boyunca hizalı olarak yerleştirilmiş 8-10 cm yüksekliğinde x 30 cm genişliğinde bir tohum çimlenme kağıdı (yumurtlama kağıdı) ile döşenmiş plastik bir 460 mL bardağa ekleyin. Yumurtlama kağıtlarını günlük olarak kontrol edin, her 2-4 günde bir değiştirin ve yumurta yüklü yumurtlama kağıtlarını% >50 Rh19’da 24-48 saat kurumaya bırakarak dikkatlice saklayın.NOT: Yumurtaların yumurtadan çıkmasını önlemek için yumurtlama kaplarını yetiştirme kafeslerinde en fazla 72 saat bekletin. Yetişkin yetiştirme kafeslerini, parçalamadan ve yeni yetişkin yetiştirme kafesleri kurmadan önce 3-4 haftaya kadar koruyun.Bir yetiştirme kafesini parçalamak için, yumurtlama kabını çıkarın ve temizleyin, yumurta yüklü yumurtlama kağıdını saklayın, sakkaroz çözeltisi kabını ve bal süngerini çıkarın ve temizleyin ve tüm sivrisinekleri öldürmek için kafesi dondurun. Tüm sivrisinek gövdelerini çıkarın ve kağıt havlular ve süngerli ovma pedleri kullanarak her kafesin içini ve dışını seyreltilmiş sabun ve suyla iyice temizleyin. Bir sonraki yetiştirme döngüsünde kullanmadan önce temiz kafesin en az 24 saat kurumasını bekleyin.NOT: Alerjiye yol açabilecek partikülleri gidermek için yüksek verimli filtreleme ile donatılmış vakum ekipmanı kullanın. Sakkaroz çözeltisi kapları 3-5x temizlenebilir ve tekrar kullanılabilir. Aedes aegypti larvalarının yumurtadan yetiştirilmesi80 g 3: 2 oranında sığır karaciğeri tozu: bira mayasını 2200 mL musluk suyunda karıştırarak larva besin bulamacı stoğu hazırlayın. Toz haline getirilmiş balık yemi hazırlayın. Balık gevreğini bir baharat öğütücüye dökün ve ince bir toz haline gelene kadar öğütün.NOT: Bu bulamaç bu laboratuvarda kahverengi olarak belirlenmiştir. Adım 1.1.5’ten itibaren yumurta yüklü (5.000-10.000 yumurta) yumurtlama kağıdı kullanarak, yumurta kağıdının yumurtlama hattına dik 3-7 cm’lik bir kısmını kesin ve bir tutam toz haline getirilmiş balık yemi gevreği ile birlikte musluk suyuyla yarı dolu 460 mL’lik bir kaba yerleştirin. En az 1 dakika boyunca kuvvetlice örtün ve çalkalayın.NOT: Yumurta kağıdı, embriyonasyona izin vermek için kuluçka işlemine başlamadan önce yumurtlama sonrası en az 7 gün (ancak kuluçkayı azaltabilecek 90 günden fazla olmamalıdır) saklanmalıdır. Balık yeminde bulunan bakteri ve algler, larva gelişimini tetikleyen suyu hızla oksijensizleştirir. Kabın tüm içeriğini adım 1.2.2’den 3 L musluk suyu ve 50 mL kahverengi bulamaç ile hazırlanmış bir larva yetiştirme tavasına dökün. Tavayı başlangıç tarihi, gerinim bilgileri, Tablo 1 başına besleme programı ile işaretleyin ve 28-30 °C, %>50 Rh ve 12:12 veya 14:10 L:D’de saklayın devir.NOT: 3 L suya 50 mL kahverengi oranı, Malzeme Tablosunda belirtilen belirli larva tavalarındaki suyun derinliğine dayanmaktadır. Farklı boyuttaki tavalar farklı pupa yoğunluklarını destekleyecek ve bu nedenle farklı miktarlarda su ve kahverengi bulamaç gerektirecektir. Tablo 1’de larva besleme oranları aralık olarak verilmiştir; kullanılan miktarın seçimi, su bulanıklığı, renk ve koku gibi değişkenleri kullanarak gelişmekte olan larvaların genel sağlığının deneyimine ve belirlenmesine dayanır; su üzerinde bakteriyel film varlığı; canlı ve ölü larvaların sayısı veya oranı; ve larvaların hareketliliği. 3 ila 6. günlerde, olgunlaşmamış sivrisinekleri Tablo 1’e göre toz haline getirilmiş balık yemi ile besleyin. Su eklemek, yiyecekleri azaltmak ve projenin gerektirdiğinden 2-3 ekstra tava kurmak, sağlıksız larva tavalarını yönetmenin yollarıdır. Gün Hacim besleme bulamacı eklendi Hacim suyu eklendi Eylemler 1 50 mL (bulamaç) 3000 mL 2 (yemek yok) (su yok) 3 1/4 – 1/2 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi) 500-1000 mL 4 1/2 – 3/4 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi) 500-1000 mL 5 1/2 – 3/4 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi) 500-1000 mL 6 1/4 – 1/2 çay kaşığı (toz haline getirilmiş balık yemi) 500-1000 mL 7 (yemek yok) (su yok) pupaları ve larvaları suşlar Tablo 1: Aedes aegypti larvalarının toplu yetiştirilmesi için beslenme programı. 2. Erkek Aedes aegypti pupalarının ayrılması Larva tavalarından pupaları konsantre edin. Pupaların yaklaşık eşik oranına ulaşıldığında, her bir tava içeriğini bir elek (boyut 20-40) içinden dökün. Pupa ve larvaları elek içinden 3000 mL dereceli plastik bir beherde yıkamak için bir şişe musluk suyu sıkın.NOT: Pupaların yüzeye rahatça ulaşabilmesi için aşırı kalabalıklaşmayı önlemek için her 3000 mL beherine sadece 2-3 larva tavası aktarılmalıdır. Pupaların, adım 1.2.3’te belirtilen sıcaklık ve ışık koşulları altında yumurtadan çıktıktan sonra 130-140 saat arasında gelişmesi beklenmektedir. Yumurtaların kurulduğu gün gözle görülür bir yumurta kapağı bekleyin. Çevre koşullarına bağlı olarak, larvaların yaklaşık% 20-70’i yavrulanmış olacak ve 6 gün içinde elenmeye hazır olacaktır. Pupaların birden fazla 3000 mL beherde bölümlenmesi, separatöre dökülebilecek yönetilebilir hacimler sağlar. Erkek pupaları larvalardan ve dişi pupalardan ayırın.NOT: Bu adım bir operatör veya iki operatör tarafından gerçekleştirilebilir.Erkek pupaları ayıran tek bir operatör için:Adım 2.1’de üretilen her bir 3000 mL beherin içeriğini, dökülmeyi ve separatörün aşırı yüklenmesini azaltmak için birden fazla 1900 mL plastik kaba bölün. Plakalı separatörünü, separatörün tabanındaki savağın altına sert sığ 4000 mL toplama kabı yerleştirerek hazırlayın (Şekil 1). Musluk suyuyla dolu iki adet 3000 mL dereceli plastik beheri yaklaşık 3/4 doldurun.NOT: 3000 mL plastik dereceli beherlere alternatif olarak bir lavabo hortumu kullanın. Aksi takdirde, beherlerin ayırma işlemi boyunca sürekli olarak yeniden doldurulması gerekecektir. Pupa separatörün çalıştırılması için ek ayrıntılarreferans 12,20’de bulunabilir. Cam plakalar arasındaki boşluktan su dökün ve üst ve alt düğmeleri saat yönünde veya saat yönünün tersine ayarlayarak suyun sürekli olarak akmasını sağlayın ve aynı anda plakaların tabanından yaklaşık 1,25 cm yüksekliğe kadar ayakta duran su üretin. Alt düğmelerin başlangıç konumlarını bantla işaretleyin. Ayakta duran su, cam plakaların tabanı boyunca eşit yükseklikte ve drenaj hızıyla eşit olarak dağıtıldıktan sonra, pupa ve larva kaplarının içeriğini plakalar arasındaki boşluktan dökmeye başlayın.NOT: Küçük (erkek) ve büyük (dişi) pupalar arasında net bir ayrım bulunmalıdır; aksi takdirde, bu toplu işi yıkayın ve plakalar arasındaki boşluğu azaltmak için üst düğmeleri ayarlayın. Separatörden yavaşça su dökerken, alt düğmeleri bant işaretli başlangıç konumundan saat yönünün tersine ~ 1-2 cm mesafede, larvaların çoğu veya tamamı yıkanana ve savağı toplama kabına kaydırana kadar sürekli olarak bir çift olarak döndürün.NOT: Bir el su dökmek için kullanıldığından, diğer el plakaları yavaşça açmak için düğmeleri birer birer döndürür, ancak eşit olarak ve küçük artışlarla döndürür. Çoğu larva hızla yıkanır, ancak erkek pupalarla yakalanan bazı larvalar olacaktır. Bu başıboş larvalar ışınlanacak, ancak gelişimde gecikecek ve pupaların fokal kohortu olan yetişkinlere yakın olmayacaktır. Larvaları koloniye geri atın veya geri dönüştürün, ancak her iki durumda da, erkek pupalar ayırıcıdan yıkanmaya başlamadan önce bunları toplama kabından çıkarın. Savağın tabanındaki toplama kabı, ayrı bir kaba geri yıkanan #30 elek içinden dökülerek larvalardan temizlenirken, su akışını durdurarak işlemi duraklatın.NOT: Larvalar önce akar, ardından erkek pupalar ve son olarak dişiler (Şekil 1). Erkek larvalar yıkanana ve toplama kabına ayrılana kadar su dökmeye ve alt düğmeleri döndürmeye devam edin. Bir sonraki adımda erkek pupaların transferinden önce larvaları toplama kabından kontrol etmek ve çıkarmak için işlemi duraklatın.NOT: Erkekleri ayırmak için gereken kızarma sayısı, su dökme hızına ve düğmelerin döndürülme hızına bağlıdır. Larvaları temizlemek için genellikle 2000-2500 mL, erkek pupaları temizlemek için 1000-1500 mL ve dişi pupaları temizlemek için 200-400 mL su gerekir. Erkek pupaları toplama kabından bir lavabonun üzerine #20 elek ile dökün. Ayrı bir 1900 mL kaba dökerken erkek pupaları elek içinden geri yıkamak için 1000 mL’lik bir sıkma şişesi musluk suyu kullanın. Tüm erkek pupalar ayrıldıktan sonra, ayırıcıdan su dökmeye devam edin ve alt düğmeleri dişi pupalardan akacak şekilde ayarlayın. Adım 2.2.1.6’da açıklanan elek işlemini kullanarak dişileri, olgunlaşmamış tüm sivrisinekler ayırıcıdan temizlenene kadar ayrı bir kaba aktarın. Dişi pupaları atın. Toplu işlem tamamlandıktan sonra, düğmeleri orijinal başlangıç konumlarına geri döndürün ve işlemi bir sonraki partiyle tekrarlayın. Tüm partiler işlendikten sonra, separatörün kuruması için plakaları açık bırakın.NOT: Bu cihazı kullanarak sabır ve pratik gerektiren mükemmel bir ayrım yoktur. İnatçı pupa veya larvalar ağır bir su akışıyla yerinden çıkarılabilir, ancak onları yanlara ittiği ölçüde değil, gelecekteki su baskınlarını kirletebilir. Erkek pupaları ayıran iki operatör için, bölüm 2.2.1’i aşağıdaki gibi değiştirin.İlk operatör: Ayırıcıdan su dökün ve larvaları, erkek pupaları ve dişi pupaları ayırmak için düğmeleri kademeli olarak döndürün. İkinci operatör: Her aşama savak kabına toplandıktan sonra, larvaları, erkek pupaları ve dişi pupaları çoklu, ayrı savak toplama kaplarına bölmek için savak kabının içeriğini eleyin. Bir lavabo hortumu mevcut değilse, büyük beherleri suyla dolu tutun. Resim 1: Bir grup olgunlaşmamış Aedes aegypti içeren pupa ayırıcı. Ayırma, hedeflenen küme, yani larvalar, erkek pupalar veya dişi pupalar, kalan kümelerden mümkün olduğunca izole edilene kadar alt düğmeleri saat yönünün tersine 1-2 cm döndürürken ayırıcıdan su dökerek başlar (soldaki resim). Sağ görüntü larvaların (en düşük bant), erkek pupaların (orta bant) ve dişi pupaların (üst bant) ayrılmasını göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 3. Işınlama için erkek Aedes aegypti pupalarının hazırlanması Erkek pupaları plastik 60 mm Petri tabaklara bölün.NOT: İhtiyaç duyulan Petri bulaşıklarının sayısı, ışınlama için kaç erkek pupanın mevcut olduğuna bağlıdır: 1.2. adımdan itibaren bir larva yetiştirme tavası yaklaşık 1.5 Petri kabını dolduracaktır. Pupa yaşının yaşı 1 ila 40 saat arasında değişmektedir. Bu protokolde, Petri kabının daha küçük çaplı daha derin yarısına alt ve daha büyük çaplı sığ yarısına üst denir.Petri kabı tabanının iç çapına uyacak şekilde önceden kesilmiş filtre kağıdı diskleri hazırlayın. Pupaları taşıma ve ışınlama işlemi boyunca nemli tutmak için Petri bulaşıklarının her bir tabanına bir adet suyla nemlendirilmiş filtre kağıdı diski yerleştirin. Pupaları Petri kaplarına aktarın. Adım 2.2.1.6’da toplanan erkek pupaları bir elek ile süzün ve pupaları mümkün olduğunca az suyla 1000 mL dereceli bir beherde yıkayın. Her filtre kağıdı diski tek bir pupa tabakası ile eşit şekilde kaplanana kadar pupaları Petri kaplarına dikkatlice dökün (Şekil 2A – C). Dökülmeyi kolaylaştırmak için Petri tabaklarını üst üste bir masanın kenarına yerleştirin.NOT: Pupaları süzmeye bir alternatif, plastik 3 mL Pasteur pipetin ucunu pupaları barındıracak kadar büyük bir çapa getirmektir. Pipetleri kullanarak pupaları adım 2.2.1.6’da üretilen kaptan doğrudan filtre kağıdı disklerine aktarın, böylece her Petri kabında yakından paketlenmiş tek bir pupa tabakası bulunur. Bu sadece küçük partiler için pratiktir. Seks adımı (3.2) ve taşıma sırasında pupa hareketini önlemek amacıyla Petri kabının tabanından durgun suyu çıkarmak için değiştirilmemiş 3 mL Pasteur pipet kullanın. Şekil 2: Pupaların ışınlama için Petri kaplarına aktarılması . (A) Elenmiş pupalar dökülür ve 1000 mL’lik plastik bir beherin içine geri yıkanır. (B) Petri kaplarına dökülmeyi kolaylaştırmak için beherde minimum su tutulur. (C) Petri tabakları, tek bir pupa tabakasına dökülmeyi kolaylaştırmak için bir yüzeyin kenarı boyunca sıralanmıştır. (D) Pupa yüklü Petri kapları, ışınlama tesisine teslim edilmek üzere istiflenir ve sabitlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Kadınlarla kontaminasyonu kontrol etmek için pupaları cinsiyetlendirin. Diseksiyon kapsamında, ventral yüzeyi erkek cinsiyetini gösteren büyük boyutlu bir genital lob için kontrol etmek üzere her bir pupayı döndürmek için problar kullanın (Şekil 3). Pupayı dişileri gösteren azaltılmış veya küçük genital loblarla çıkarın ve atın ve doğru sayımı korumak için eşit sayıda erkek pupa ile değiştirin.NOT: Operasyonel bir programda, bu adım çok sayıda sivrisinek ve ışınlamadan sonra ayırma, aktarma, ışınlama ve kafes hazırlamanın sınırlı bir süre ile bir günde yapılması nedeniyle pratik değildir. Seçkin Petri yemeklerinden bir numunenin kalite kontrolü, özellikle SIT programının geliştirilmesinin erken aşamalarında yapılabilir. Şekil 3: Genital lob kullanılarak seksleme pupaları . (A) Ventral ve (B) dişi () ve erkek (♀ ♂) Aedes aegypti pupalarının lateral görünümleri, genital lobların cinsel dimorfizmi gösterdiği belirtildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Alt kısımları Petri tabaklarının üst kısımlarıyla örtün ve laboratuvar bandı ile sabitleyin. Bantlanmış Petri kaplarını, ışınlama odasına sığacak boyutta yığınlar halinde elastik bantlarla bir araya getirin ve etiketli 3,8 L yeniden kapatılabilir bir torbanın içine kapatın (Şekil 2D). Pupaların >1 saat boyunca açıkta kalmasına izin vermeyin. 4. Erkek Aedes aegypti pupalarının ışınlanması 1cm2 film karesini keserek ve her kareyi ayrı ayrı zarfına yerleştirerek aynı partiden dozimetri filmi hazırlayın.NOT: Her gün kullanılan tüm filmler aynı anda kesilir. Bu, depolamanın neden olduğu az miktarda varyasyonu azaltır. Her yığın için gereken kare sayısı 1 +’dır (Petri kabı sayısı). Bir laboratuvar zamanlayıcısı, laboratuvar bandı, kalıcı işaretleyici, hazırlanmış dozimetri filmi zarfları, dozimetri rozeti ve önemli bilgileri takip etmek için kontrol listeleri içeren bir laboratuvar not sayfası içermesi gereken ışınlama tesisine almak için bir kit hazırlayın (Şekil 4). Şekil 4: Bir doz yanıt seti için tamamlanan laboratuvar kitabı taslağı-IR sayfası. Kırmızı renkle özetlenen (kırmızı oklarla işaretlenmiş) metin kutuları, farklı bölümlerle ilgili yararlı notları gösterir ve önemli bilgileri yineler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Pupaları ışınlama tesisine taşıyın. Erkek pupaların Petri tabaklarını adım 3.3’ten itibaren yalıtımlı kaplara yerleştirin ve taşıma sırasında doğrudan güneş ışığından ve klimadan uzak tutun. Işınlayıcıda ışınlama için Petri bulaşıkları yığınları hazırlayın. Her bir çanak arasında ve yığının üstünde ve altında ortalanmış bir dozimetri filmi zarfı ile ışınlama odasına sığacak uygun sayıda Petri kabını istifleyin. Dökülmeleri önlemek ve yığının hazneye yerleştirilmesini kolaylaştırmak için zarfları ve tüm yığını laboratuvar bandı ile sabitleyin. Erkek pupaların Petri yemeklerini ışınlayın. Petri çanak yığınını, spesifik ışınlama ünitesi21’in önceki doz haritalamasına dayanarak optimum maruz kalma konisi için doğru yüksekliğe konumlandırmak üzere haznedeki sert metal ağ üzerine yerleştirin. Işınlayıcı üzerindeki döner tablayı etkinleştirin ve ışınlayın, aynı anda laboratuvar zamanlayıcısını başlatın. İstenilen dozu gerçekleştirmek için uygun aralık için ışınlama yapın (örnekler Tablo 2’de gösterilmiştir).NOT: Bu protokol bir sezyum-137 ışınlayıcıya ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 50 Gy’lik bir hedef doza dayanmaktadır. Cs-137 zamanla bozunduğundan, ışınlanmış numunelerin yaklaşık% 10’unda rutin dozimetri ve alanin için radyokromik film ile desteklenmiş alanin dozimetreleri kullanılarak bir doz-yanıt serisi gerçekleştirilerek doz oranı her yıl ayarlanır. Mevcut 8.8 Gy / dak doz oranı göz önüne alındığında, 50 Gy’lik hedef doza ulaşmak 5 dakika, 41 s maruz kalmayı gerektirir. Rutin film dozimetrisi, adım 4.7’de açıklandığı gibi gerçekleşir. Alanin pelet dozimetrisi, Texas A & M Üniversitesi’ndeki Ulusal Elektron Işını Araştırma Merkezi’nde veya Gaithersburg, MD, ABD’deki Ulusal Standartlar ve Teknoloji Enstitüsü’nde gerçekleştirilir. Dozaj (Gy) Zaman (8,8 Gy/dk’ya göre) 0 NA 10 1 dk 8 sn 30 3 dk 24 sn 50 5 dk 41 sn. 65 7 dk 23 sn 85 9 dk 39 sn 100 11 dk 22 sn 110 12 dk 30 sn Tablo 2: Sezyum-137 ışınlayıcı için örnek dozaj süreleri. Öngörülen süre geçtikten sonra, Petri bulaşıklarını ışınlayıcıdan çıkarın ve yığını dikkatlice sökün. Tüm Petri tabaklarını ve film zarflarını yığındaki tarih ve konumla etiketleyin. Zarfları kapatın ve dozimetri için saklayın. Petri tabaklarını ana laboratuvara geri götürmek üzere yalıtımlı kaba yeniden paketleyin.NOT: Yetişkinlerin ışınlama sırasında ortaya çıkıp çıkmadığını kaydedin ve etkilenen Petri kabını işaretleyin, böylece pupalar yetiştirme kafeslerine yerleştirildiğinde yetişkin (ler) kaçmayacaktır (adım 5.2). Filmi maruz kaldıktan yaklaşık 24 saat sonra ölçerek dozlama dozunu dozimetri filmi ile onaylayın. Dozimetri okuyucuyu etkinleştirin ve oda sıcaklığına dengelenmesine izin verin. Filmi okuyucuyla birlikte verilen forseps kullanarak yükleyin ve ışınlanmış filmi ve ışınlanmamış boş filmi aynı partiden okumak için üreticinin talimatlarını izleyin. Okumalar arasında film olmadan okuyucuyu sıfırlayın ve Şekil 5’te gösterilen örnek veri sayfasında olduğu gibi verileri kaydedin.NOT: Bu protokol ND0.5 ve ND1.0 QA Filtre Seti standartlarını temel alır. Filmi, mat tarafı operatöre bakacak şekilde ölçmek önemlidir. Şekil 5: Örnek verilerle doldurulmuş dozimetri veri sayfası. Sütun başlıkları, operatörden daha sonra analiz edilmek üzere anahtar verileri yakalamasını ister. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. 5. Işınlanmış erkek Aedes aegypti pupalarının yetişkinlere yetiştirilmesi 30 cm x 30 cm x 30 cm boyutlarında küçük plastik yetiştirme kafeslerini temizleyin ve hazırlayın, böylece ana laboratuvara döndüklerinde ışınlanmış pupalara hazır olurlar. Işınlanmış erkek pupaların her 2 Petri kabı için 1 yetiştirme kafesi hazırlayın. Her yetiştirme kafesini, adım 1.1.3’te açıklandığı gibi, 460 mL musluk suyu ve% 10 sakkaroz çözeltisi kabı içeren yarı dolu bir plastik kap ile stoklayın. Işınlanmış pupaları, ışınlama tesisinden döndükten sonra derhal hazırlanan yetiştirme kafeslerine aktarın. Her Petri kabındaki pupayı, her yetiştirme kafesindeki plastik bardaktaki 460 mL suya dikkatlice yıkamak için bir şişe su sıkın. 24 saat sonra, bardakları besin kaynağını içeren yeni, temiz yetiştirme kafeslerine aktarın ve yetişkin, erkek ışınlanmış Aedes aegypti’nin kalan eklozyonunu bekleyin.NOT: Işınlama işlemi sırasında pupa ortaya çıktıysa, Petri çanaklarını el ilanlarıyla birlikte boş bir kafese açın ve ardından adım 5.2 ile devam edin. Bu kafeste toplanan erkekleri atın. Pupa 24 saat sonra yeni yetiştirme kafeslerine aktarılır, çünkü erkekler aynı kohortun dişilerinden önce ortaya çıkar ve ortaya çıkma günlerini izole etmek kadın kontaminasyon insidansını azaltabilir ve erkeklerin doğru yaşlanmasını sağlayabilir. 6. Işınlanmış yetişkin Aedes aegypti erkeklerinin işaretlenmesi ve tartılması NOT: Protokolün bu bölümü, iki kişinin görevleri yerine getirdiğini varsayar; 1 kişi için bkz. 6.4. Resim 6: İşaretli, ışınlanmış, erkek Aedes aegypti’nin serbest bırakma kaplarına ambalajlanması. (A) Maskeleme bandı, zımbalar ve sıcak tutkal ile karton silindirinin yan tarafında kesilmiş bir deliğe tutturulmuş şarampole tutturulmuş stoğu gösteren kabı serbest bırakın. Çerçeve, yan tarafa yapıştırılmış bir maskeleme bandı etiketi desteği ile yerine oturtulmuştur. Çerçeve, sıkıca çekilmiş tül örgü kapağını koruyor; elastik bir bant (görünmez) de tülü çerçevenin altında yerinde tutuyor. (B) Küçük bir karton kapta pembe boya ile yuvarlanma sürecinde anestezi uygulanan erkeklerin partisi. (C) Yalıtımlı nakliye konteyneri içinde dört serbest bırakma konteyneri. Stokinette manşonların nakliye konteynırının ortasına yönlendirildiğini, ambalaj malzemelerinin serbest bırakma kaplarının etrafına sıkıştığını ve çapraz elastik bantlar ve bant parçaları tarafından hızlı bir şekilde tutulan ters çevrilmiş bir Petri kabı tabanı ile kaplanmış her bir serbest bırakma kabının üstünde beslenme ve hidrasyon kaynaklarının bulunduğunu unutmayın. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Karton serbest bırakma kapları hazırlayın.Kapaklı, silindirik 3,9 L karton kabın yan tarafındaki 11,5 cm çapında bir deliği, alttan 1,5-3,0 cm yükseklikte kesin, böylece delik kapakla kaplanmayacaktır (Şekil 6A). 40-50 cm uzunluğunda bir stockinette kesin ve bir ucunu 6.1.1’de kesilmiş 11.5 cm’lik deliğin iç kısmına zımbalayın. Zımbaların haznenin içinden ve kartondan geçerek sert ekstrüde polistiren köpük bloğu gibi uygun bir çalışma yüzeyine zorlanabilmesi için standart bir ofis zımbalayıcı kullanın. Stolineti deliğin çevresine sıkıca sabitlemek için düz başlı bir tornavida kullanarak zımbaları sıkın ve takılmaları önlemek için maskeleme bandını kıvrımlı tarafa sabitleyin. Silindirin içindeki şarampole kenarını sıcak tutkalla kartona kapatın ve tüm tertibatı kaçış delikleri için çapraz kontrol edin. İç diski kapaktan çıkararak bir tutucu çerçeve oluşturun ve yetişkin erkek Aedes aegypti sivrisineklerini tutacak kadar ince bir 33 cm x 33 cm kare naylon tül örgü kesin. Ağı silindirin açık ucuna yerleştirin ve çerçeveyi boşluk bırakmadan yerinde tutmak için ağın üzerine yerleştirin. Ağın açık uç boyunca öğretilmesini sağlamak için ağı çerçevenin altına çıkıntı yapacak şekilde aşağı doğru çekin ve çıkıntılı ağı silindire karşı lastik bir bantla sıkıca kapatın. 8 cm’lik bir etiketleme bandı parçasıyla kaplı çerçevenin yan tarafına 10 cm’lik bir maskeleme bandı parçası yerleştirin, böylece etiketleme bandı çerçeveyi yırtmadan kolayca değiştirilebilir.NOT: Serbest bırakma kapları dayanıklıdır ve uygun kullanımla >10x tekrar kullanılabilir. Her yeni işaretli, ışınlanmış, yetişkin, erkek sivrisinek grubunu tanıtmadan önce, stokun kaba güvenli bir şekilde tutturulduğunu kontrol edin ve gerekirse derhal onarım yapın. Tartım ve işaretleme istasyonunu hazırlayın.240 mL’lik bir karton kaba yaklaşık 50 mg işaretleme boyası dökün ve boyayı kabın iç yüzeylerine eşit olarak bir toz tabakası olarak yayın. Fazla boyayı atmak için hafifçe dokunun. Renkleri ayrı tutmak için birden fazla boya için açıkça etiketlenmiş kaplar kullanın. 0,0001 g elektronik terazide 100-500 g ağırlığındaki bir tekneyi dara edin; bir veri formu oluşturmak (Tablo 3); ve 431,8 mm x 711,2 mm çalışma yüzeyi oluşturmak için dört yaprak 215,9 mm x 355,6 mm kopya kağıdını birlikte bantlayın. Serbest Bırakma Kabı Sivrisineklerin ağırlığı Kafes Numarası Toplu Dişiler Erkek Sayısı Serbest Bırakma Kabı Toplam Kütle PEMBE I 0.024 D1 #1 25 PEMBE I 2.03 PEMBE I 2.007 D1 #1 7 PEMBE II 1.99 PEMBE II 1.990 D1 #1 PEMBE III 2.03 PEMBE III 0.026 D1 #3 25 PEMBE III 2.000 D1 #3 18 Tablo 3: Tartım istasyonu veri tablosu. Floresan pigmentli yetişkin ışınlanmış erkeklerin niceliklendirilmiş partilerini işaretleyin.Yetişkin sivrisinekleri (2.5-3.5 günlük) her yetiştirme kafesinden aspiratör şişelerine aktarın. Yetiştirme kafesinden besin kaynaklarını adım 5.2’den çıkarın ve tüm kafesi 5-7 dakika boyunca büyük bir CO2 odasına yerleştirin, yetiştirme kafesine yapışmış olabilecek sivrisinekleri yerinden çıkarmak için kabın kenarlarını vurun. Maruz kalma süresi geçtikten sonra, yetiştirme kafesini odadan çıkarın ve tüm yetişkin sivrisinekleri bir dizi plastik aspirasyon şişesine aspire edin.NOT: ,5-100 CO2’nin uygulanması, hazneye 6 L/dak akış hızında kanalize edilmiş regülatör, pirinç diken ve silikon borulu bir tanktan yapılır. Yetiştirme kafesini temizlemek için gereken şişe sayısı, kafeste kaç sivrisinek bulunduğuna ve operatörün yeterliliğine bağlıdır, ancak kafes başına tipik olarak 3-5 şişe gereklidir. Yetişkin sivrisineklerin gruplar halinde yönetimini kolaylaştırmak için küçük hızlı değişim şişelerine sahip bir aspiratör seçin, örneğin, bir ucunda 20 x 20 mesh alüminyum ekran ve diğer ucunda net bir asetat flep valfi ile kapatılmış 60 mL polistiren toplama şişesi kullanın. Sivrisinekler üzerindeki stresi azaltmak ve protokolü izlenebilir tutmak için sivrisinekleri şişelere aktarma süresini azaltmak için aspirasyondan önce tüm kafes anestezi altına alınır. Tüm yetişkin sivrisinekleri her yetiştirme kafesinden cinsiyete göre sıralayın.İlk şişeyi adım 6.3.1’den CO 2’ye kadar küçük bir odada 4 dakika boyunca maruz bırakın ve ardından anestezi uygulanan sivrisinekleri hafifçe sallayın ve bunları adım 6.2.2’de hazırlanan beyaz kağıt çalışma yüzeyine yayın. Aspiratöre yeni bir boş şişe yükleyin ve tüm erkekleri çalışma yüzeyinden dikkatlice aspire edin ve bu şişeyi tartım istasyonuna geçirin (adım 6.3.3.). Geride kalan dişileri toplayın ve onları ayrı bir şişeye aspire edin ve ezilmiş erkeklerle birlikte atın. Bu işlemi 6.3.1’den kalan şişelerle tekrarlayın, ancak cinsiyet sıralama işleminin bir noktasında, tartım istasyonuna da geçirilen sadece 25 erkekten oluşan ayrı bir şişe oluşturun. Adım 6.3.2’yi yineleyin. her yetiştirme kafesi için.NOT: Işınlanmış yetişkin erkekleri cinsiyetlendirme, tartma ve işaretleme için işlerken, pupa cinsiyet sıralamasının ve tüm sürecin sorun giderme ve kalite güvencesi için kilit veriler olan her partideki kadın sayısını takip edin. Kadın sayısı beklenenden yüksekse, ana operatör erkekleri aspire ederken ikinci bir kişi dişileri çıkarmalıdır. Sivrisinek başına ortalama bir ağırlığı hesaplamak için her yetiştirme kafesinden 25 erkekten oluşan bir numunenin tartılması önemlidir; bu, protokolün sonunda salınan işaretli ışınlanmış erkeklerin sayısını tahmin etmek için kullanılacaktır. Yetişkin erkek sivrisineklerin partilerini tartın ve boyayın.Tartım istasyonunda, yetişkin erkek sivrisineklerin ilk şişesini seks istasyonundan (bölüm 6.3.2) 2 dakika boyunca küçük bir CO2 odasına yerleştirin ve sivrisinekleri adım 6.2.2’de hazırlanan katranlı tartım teknesine dikkatlice sallayın. Sivrisineklerin ağırlığını kaydedin ve sivrisinekleri 6.2.1’de hazırlanan boya kabına dökün. Bardağı yavaşça eğin ve döndürün 1 tam dönüş saat yönünde ve saat yönünün tersine çevirin, böylece sivrisinekler kabın iç yüzeylerindeki toz kaplamaya temas eder ve hepsi boya ile hafifçe tozlanır (Şekil 6B). İşaretli sivrisinekleri bir tartım teknesine dökün. Sivrisineklerin iyileşmemesi ve kaçmaması için bir sonraki adıma hızla ilerleyin. Bölüm 6.3.2’deki tüm şişeler işlenene kadar bu adımı tekrarlayın.NOT: Bölüm 6.3.2’de her yetiştirme kafesi için üretilen 25 erkekten oluşan ayrı şişeden erkeklerin ağırlığı kaydedilir ve bu kafesten erkek başına ortalama ağırlığı hesaplamak için kullanılır. Serbest bırakma kaplarını işaretli ışınlanmış yetişkin erkeklerle yükleyin. Bölüm 6.3.3’ün sonundan anestezi yapılmış, işaretlenmiş, ışınlanmış, erkek sivrisinekler içeren tartım teknesini hafifçe katlayın. Bir kanal oluşturmak için ve daha sonra erkekleri serbest bırakma kabına aktarmak için bu kanalı stockinette manşonundan yönlendirin. Yaklaşık 2.0 g veya 1500-3000 erkek sivrisinek serbest bırakma kabında olana kadar sivrisinekleri eklemeye devam edin ve stockinette manşonunu kapatın. Serbest bırakma kabının çerçevesindeki etiketleme bandını boya rengi, kap numarası ve sivrisineklerin toplam ağırlığı ile işaretleyin ve bu verileri adım 6.2.2’deki forma kopyalayın.NOT: Sivrisineklerin herhangi bir yaşam evresinde taşınması strese neden olur ve hayatta kalma veya canlılığı azaltabilir. Bu protokolde açıklanan anestezi serileri sivrisinekleri etkileyebilir; Bununla birlikte, her adımda anestezi yapılmamış sivrisinekleri takip etme ve aspire etme girişimleri daha fazla strese ve sürdürülemez bir protokole neden olacaktır. Her bir salınım kabındaki sivrisineklerin toplam ağırlığını, bu salınım kabındaki erkek sayısının bir tahminini elde etmek için bölüm 6.3.3’te üretilen erkek sivrisinek başına ortalama ağırlığa bölün; Her serbest bırakma kabı, yaklaşık 1 büyük yetiştirme kafesine eşit olan 2 g’dan fazla erkeğe sahip olmamalıdır. Tek bir operatör için işaretleme protokolünde yapılan değişikliklerÖnce tüm büyük kafesler için seks sıralama yapın. Her büyük kafesi 4-5 dakika boyunca CO2’ye maruz bırakın ve tüm sivrisinekleri 4-5 şişeye aspire edin. Her şişeyi 2-3 dakika boyunca CO2’ye maruz bırakın, tüm sivrisinekleri beyaz kağıt çalışma yüzeyine atın, dişileri çıkarın ve sayım yapın ve erkekleri büyük popülasyon kafeslerine geri döndürün. Tartım ve markalamaAdım 6.4.1’de üretilen ilk erkek tutma kafesi ile başlayın: beslenme kaynağını çıkarın ve erkekleri 5-7 dakika boyunca büyük bir CO2 odasında uyuşturun. Anestezi uygulanan erkekleri ayrı şişelere eşit şekilde aspire edin. Bu adımı, her bir tutma kafesi ile üretildikleri sırayla tekrarlayın.NOT: Tutma kafesi başına yaklaşık 2-3 adet kalabalık şişe üretilecektir. Erkek tutma kafeslerinin üretildikleri sırayla işlenmesi, her bir erkek kafesi için iyileşme süresini en üst düzeye çıkarır. Adım 6.4.2.1’de üretilen ilk şişeyi anestezi altına alın. küçük bir CO 2 odasında1-2 dakika boyunca. Beyaz kağıt çalışma yüzeyine az sayıda sivrisinek dökün, 25 erkek sivrisineği yeni bir şişeye aspire edin ve bu kafes için erkek başına ortalama ağırlığı belirlemek için 6.3.2’deki gibi işleyin. Ek erkekleri kaynak şişeye iade edin veya daha sonra işlenmek üzere yeni bir ayrı şişeye aspire edin; adım 6.3’ün geri kalanında açıklandığı gibi ilk şişedeki erkeklerin geri kalanı için tartım, işaretleme ve serbest bırakma kaplarına aktarma işlemine devam edin. 6.4.2.2 adımını yineleyin. Adım 6.4.2.1’de üretilen şişelerin geri kalanı için (25 erkeğin ayrı bir şişede izole edilmesi hariç). üretildikleri sırayla ve daha sonra 6.4.1’de üretilen bir sonraki cinsiyete göre sıralanmış yetiştirme kafesine geçin.NOT: Bir kişiyle iş akışları daha yavaştır ve bazı erkek sivrisineklerin birden çok kez anestezi altına alınması gerekir. Sürekli dişi sivrisinekleri arayın ve çıkarın. 7. İşaretli, ışınlanmış, yetişkin erkek Aedes aegypti’nin ambalajlanması ve nakliye serbest bırakma konteynerleri Serbest bırakma konteynerlerini sevkiyat için hazırlayın. Bir serbest bırakma kabı işaretli erkeklerle doldurulduktan sonra, ağ kapağına% 10 sakkaroz çözeltisi ile nemlendirilmiş 4 pamuk topu yerleştirin ve bir haç oluşturmak için tüm kabın etrafına ve Petri kabının üzerine gerilmiş iki lastik bant tarafından yerinde tutulan bir Petri kabının ters çevrilmiş bir tabanıyla örtün. Ters çevrilmiş Petri kabının üstünde yerinde tutmak için iki lastik bandın X’inin üzerine bir parça maskeleme bandı yerleştirin.NOT: % 10 sakkaroz çözeltisi içeren pamuk toplarının, kabın zarar görmesine ve sivrisinekleri yakalayıp öldürmesine neden olacak damlama noktasına doygun olmadığından emin olun. Karton serbest bırakma kaplarını ekstrüde polistiren köpük nakliye soğutucusuna paketleyin. Soğutucu kapaktan 4 havalandırma deliği açın ve karıncaları dışarıda tutmak ve kaçan sivrisinekleri tutmak için pamukla tıkayın. 4 serbest bırakma konteynerini, her bir konteynerin stoğu merkeze bakacak şekilde nakliye soğutucusuna dik olarak yerleştirin (Şekil 6C). Stabilize etmek için kabarcık sargısını her bir kabın arasına ve merkeze yerleştirin. Nakliye soğutucusundaki alanın geri kalanını hava yastıklarıyla doldurun veya 4 serbest bırakma kabından oluşan ikinci bir katmanı doğrudan ilk katmanın üzerine istifleyin ve benzer şekilde hava yastıklarıyla stabilize edin.NOT: Serbest bırakma kapları, çalkalandığında hareket etmeyecek kadar stabilize edilmelidir. Paketin içindeki sıcaklık ortamdır. Nakliye soğutucusunu teslimat için hazırlayın. Nakliye soğutucusunu havalandırmalı kapakla kapatın ve karton üst ambalajın içine yerleştirin, bant kapatın ve gece ekspresi ile serbest bırakma konumuna gönderin.