本文演示了定制成像窗口的制备,并辅以输液管,并将其植入小鼠海马的CA1区域。
在清醒动物中以单细胞分辨率成像神经元活动是研究系统神经科学神经回路功能的一种非常有力的方法。然而,哺乳动物组织中高吸收和光散射将内视成像主要限制在表面大脑区域,使深脑区域(如海马)无法进行光学显微镜检查。在这段视频中,我们展示了定制成像窗口的准备和植入,以便对头部固定行为小鼠的背部海马 CA1 区域进行慢性 体内 成像。定制窗口辅以输液管,允许有针对性地将病毒载体和药物输送到成像区域。通过将这种制备与广域成像相结合,我们使用来自大块神经元组的荧光钙指示器对神经元活动进行了长期记录。我们还演示了这种具有单尖峰分辨率的电压成像制备的适用性。高性能的神经元活动基因编码指标和科学的CMOS摄像机允许以高时间分辨率反复可视化单个神经元的亚细胞形态细节。我们还讨论了上述方法的优势和潜在局限性,以及它与其他成像技术的兼容性。
海马是一个关键的大脑区域,负责学习和记忆1以及空间导航2。河马萎缩与神经和精神疾病有关,包括记忆丧失和认知衰退3,4,5。在小鼠中,海马体是研究细胞和网络4级、5级空间、上下文和关联学习和记忆形成的非常成熟的模型。学习和记忆的机械学研究需要对行为小鼠的神经元结构和功能进行纵向询问。荧光成像与基因编码探针6相结合,提供了前所未有的能力,记录膜电压动力学7,8,钙瞬态9,和结构变化10在神经元内大子集。然而,小鼠进入海马的光学通道受到皮层的阻塞,皮层的厚度可能超过1毫米。在这里,我们描述了一个程序,组装一个定制的成像设备,并将其长期植入小鼠头,以便长期光学访问在行为小鼠的背部海马的CA1亚区域。注入纳入成像植入物的输液管允许将病毒或药物直接传到视场的神经元上。所述制备与广场显微镜相结合,能够长时间对行为小鼠中大型神经元子集进行反复成像。我们利用这种制剂,通过有针对性地注入重组腺相关病毒(rAAV),以单细胞分辨率进行神经元活动记录,来表达海马CA1区域的钙和电压基因编码指标。我们还对相应的神经元子集进行了纵向钙成像,其空间分辨率很高。此外,这种制备与多光显微镜和显微镜相容,从而进一步扩大成像技术的工具箱,以研究小鼠细胞和细胞亚细胞水平的神经元网络。我们描述了协议的关键步骤和故障排除。我们还讨论了该方法可能的缺陷和局限性。
在这里,我们描述了一种长期成像海马CA1区域的方法。该方法基于定制成像窗口的慢性植入,这也使病毒或药物的靶向管理直接到感兴趣的神经元。本协议由四个主要部分组成:一) 成像植入物的组装:(二) 安装成像植入物:iii) 通过成像植入注射病毒:iv) 行为小鼠的功能成像。下面我们描述和讨论协议中的关键步骤、故障排除、修改和方法的局限性。我们还讨论了该方法的重要性及其潜在的替代应用。
在所述协议中有几个关键步骤对于成功的手术非常重要:(一) 准备高质量的成像植入物:(二) 无菌手术条件:(三) 皮层的渴望;(四) 成像植入物的精确放置:(v) 病毒注射。正如步骤 1.6 所示,过量焊接锡需要更大的颅骨切除术,从而增加炎症的风险。正如步骤 1.11 所示,在将盖玻璃固定到成像罐中时,使用适量的胶粘剂光学胶水也非常重要,因为量不足可能导致脑脊液泄漏到成像管中,使其不透明。另一方面,过量的光学胶粘剂会导致玻璃窗透明度降低。成像植入物可能受到污染,可能导致光学窗口下结缔组织活跃增殖和/或严重炎症,这将导致实验提前终止。因此,手术前的成像植入物组装和准备几乎与外科手术本身一样重要。
在手术过程中,颅骨切除术下皮层的一部分被温柔的渴望所消融,导致不可避免的出血。手术部位的血液显著降低了必须切除的脑组织的可见性。这使组织消融所需深度的精确评估复杂化。在应用吸力去除组织下一部分之前,每次都要用 PBS 小心地冲洗手术部位,从而更好地控制深度。脑组织应始终以小份分步切除,以确认消融组织的深度,然后再进行更多的吸力。更精细的吸力控制也可以用更薄的钝针实现。我们建议使用26G针,但是,小于26G直径更容易堵塞。此外,通常需要大量的实践来确定每种动物所需的精确渴望深度,因为皮层、体质和海马的颜色可能因小鼠而异(图3)。
应非常精确地插入和固定成像植入物,以确保成像窗口尽可能接近海马体的后部表面。准备的颅骨切除术的大小应与植入物紧密匹配,并允许其插入,没有明显的阻力。同时,头骨和植入物之间不应有明显的间隙,以确保适当的密封和避免脑组织暴露。在植入物密封到头骨时,应向植入物顶部施加温和而稳定的压力。在植入装置期间,几乎不可避免的是成像窗口下有血液。如果手术做对了,窗户应该在3-7天内清理干净,脑血管变得清晰可见。确保病毒在窗口下正确注射也很重要。在表达失败的情况下,病毒可以多次重新弹出。
在某些情况下,我们遇到的主要并发症是成像窗口的可见性降低。成像质量差有几个可能的原因:一) 持续炎症:ii) 玻璃上结缔组织生长:iii) 窗户和海马之间的巨大差距。炎症通常是由手术过程中的污染或未正确消毒的成像植入物引起的。我们建议在每次手术前后自动切割手术器械,手术前立即对手术区进行消毒,并在手术过程中佩戴干净的个人防护设备。成像植入物应在组装、消毒和储存在无菌条件下后进行清洁。成像植入物玻璃上的结缔组织生长可能是由于玻璃表面的机械污染或皮层消融期间脑组织的过度创伤。组装植入物后,确认玻璃表面清洁光滑非常重要。此外,所有受损的脑组织在将成像植入到颅骨切除术中之前都必须小心切除。在某些情况下,玻璃窗和海马之间的间隙会导致脑脊液的积累,降低成像质量。因此,在植入安装过程中,必须一直插入它,以确保海马体和玻璃窗之间的良好接触。有时,很难确定不透明成像窗口的确切原因。我们建议进行验尸分析,以揭示光学窗口下的情况,并相应地调整后续手术。
该方法有几个基本和技术限制,应考虑在体内成像之前和期间。其中一个主要限制是皮层消融。手术期间切除部分视觉和感觉皮层。虽然很难精确评估皮层消融的影响,因为被切除的脑组织不会直接投射到海马体上,但一些研究表明,海马依赖性学习或其他相关的海马功能没有明显受损。还应考虑光学限制,特别是当使用高 NA 客观透镜时。例如,在这项研究中,我们使用了1.75毫米长的内径为1.9毫米的管子。此管的几何形状不会保留完整的 NA 空气目标与 NA 超过 0.5 或水目标与 NA 超过约 0.6,因为它将夹住一些光。另一个限制,常见的所有脑成像植入物,是大脑的一部分被暴露,从而促进热量损失17,18。然而,通过灌注温暖的缓冲液,在成像过程中可以轻松恢复生理脑温。
所述方法可以很容易地修改或调整其他应用程序。例如,该制剂可以适应纹状体7的成像。由于纹状体比海马体稍深,成像管应用于组装成像植入物的时间越长。我们建议使用2.0毫米成像管。颅骨切除术的坐标应相应调整(AP: +0.8 mm,ML: −1.8 毫米)。此外,通过输液管注射病毒,允许在使用AAV血清型时,在细薄的神经元层中实现转基因的表达,并限制传播19,20。由于更深层的聚焦外荧光减少,因此改善了单细胞分辨率成像,因此对单光子成像特别有益。此外,注射管也可以用于功能成像,直接在FOV(图5B)的神经元上施用药物或其他化学物质。整体输液管为成像植入物增添了有用的功能,由于有针对性的病毒表达,提高了成像质量,并使 FOV 中的神经元能够进行药理刺激。使用过的头板提供显像植入物的非凡稳定性,即使在跑步机上主动移动的动物中,也可最大限度地减少运动物件。头板小而轻,对动物的不适程度极小,安装后几个月保持稳定。成像植入物还与多光成像15、16、21兼容,可与显微内窥镜22、23结合。类似的成像植入物也用于多光子成像的更深的海马结构,包括地层半径,地层拉库诺塞,和凹陷陀螺16,24,25,26,27。然而,通过输液管瞄准AAV的更深海马结构可能需要进一步优化AAV血清型和体积19。
我们相信,上述协议将促进研究,旨在利用简单且经济实惠的单光子成像设置,调查行为小鼠海马体内具有高空间空间分辨率的神经元活动。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢西湖大学分子生物工程组全体成员的帮助和有益的讨论。我们也感谢来自西湖大学的李金泽和贾杰敏在拍摄外科手术方面所提供帮助。
这项工作得到了西湖大学基金会的启动资金、2020年BRF青年研究员资助和中国国家自然科学基金的启动资助,32050410298全部捐赠给K.D.P.
Cover glass | Deckgläser | 72296-03 | |
denture base resin | ShangHai New Centery Dentel Material | N/A | Type I, self-solidifying |
Dummy Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62102 | OD 0.30mm |
Guide Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62003 | 26G |
Head Fork | N/A | N/A | Custom made |
Head Plate | N/A | N/A | Custom made |
Imaging Cannula | N/A | N/A | Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel |
Internal Cannula | RWD Life Science Co.,LTD | 62203 | 0.30*0.14 (OD*ID, mm) |
Kwik Sil | World Precision Instruments | KWIK-SIL | |
SuperBond C&B | SUN MEDICAL | N/A | SuperBond C&B kit |
Treadmill Kit | N/A | N/A | Custom made |
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