Craniotomy Procedure for visualisering af neuronale aktiviteter i Hippocampus af barbering mus

Summary

Denne artikel demonstrerer forberedelsen af et skræddersyet billedvindue suppleret med infusionskanyle og dets implantation på CA1-regionen i hippocampus hos mus.

Abstract

Imaging neuronale aktiviteter på enkelt-celle opløsning i vågen opfører dyr er en meget kraftfuld tilgang til undersøgelse af neurale kredsløb funktioner i systemer neurovidenskab. Men høj absorbans og spredning af lys i pattedyr væv begrænse intravital billeddannelse meste til overfladiske hjerneområder, forlader dyb-hjerne områder, såsom hippocampus, uden for rækkevidde for optisk mikroskopi. I denne video viser vi forberedelsen og implantationen af det specialfremstillede billedvindue for at muliggøre kronisk in vivo-billeddannelse af den dorsale hippocampale CA1-region i hovedfaste barbermus. Det skræddersyede vindue suppleres med en infusionskanyle, der giver mulighed for målrettet levering af virale vektorer og lægemidler til billedområdet. Ved at kombinere dette præparat med wide-field imaging udførte vi en langsigtet registrering af neuronal aktivitet ved hjælp af en fluorescerende calciumindikator fra store delmængder af neuroner i barber mus over flere uger. Vi har også demonstreret anvendeligheden af dette præparat til spændingsbilleddannelse med enkelt-spike opløsning. Højtydende genetisk kodede indikatorer for neuronal aktivitet og videnskabelige CMOS-kameraer gjorde det muligt at recurrent visualisering af subcellulære morfologiske detaljer om enkelte neuroner ved høj tidsmæssig opløsning. Vi diskuterer også fordelene og de potentielle begrænsninger ved den beskrevne metode og dens kompatibilitet med andre billeddannelsesteknikker.

Introduction

Hippocampus er en vigtig hjerneregion med ansvar for læring og hukommelse¹ samt for rumlig navigation². Hippocampal atrofi er forbundet med neurologiske og psykiatriske lidelser, der involverer hukommelsestab og kognitiv tilbagegang^3,4,5. Hos mus er hippocampus en meget veletableret model til at studere rumlig, kontekstuel og associativ læring og hukommelsesdannelse på cellulære og netværksniveauer^4,5. De mekanistiske undersøgelser af læring og hukommelse kræver langsgående forhør af neuronal struktur og funktion i barbering mus. Fluorescens imaging i kombination med genetisk kodede sonder⁶ giver hidtil usete muligheder for at registrere membran spænding dynamik^7,8, calcium transienter⁹, og strukturelle ændringer¹⁰ over store delmængder af neuroner intravitally. Imidlertid blokeres optisk adgang til hippocampus hos mus af cortex, som kan nå over 1 mm i tykkelse. Her beskrev vi en procedure for samling af en specialfremstillet billedbehandlingsenhed og dens kroniske implantation i musehovedet for langsigtet optisk adgang til CA1-underregionen af dorsal hippocampus i barbering mus. Infusionskanyle integreret i billedimplantatet giver mulighed for administration af vira eller lægemidler direkte på neuronerne inden for synsfeltet. Det beskrevne præparat i kombination med bredfeltmikroskopi muliggør tilbagevendende billeddannelse af de store delmængder af neuroner i barbermus over lange perioder. Vi udnyttede dette præparat til at udtrykke calcium og spænding genetisk kodede indikatorer i hippocampal CA1 region via målrettet injektion af rekombinant adeno-associeret virus (rAAV) til neuronale aktivitetsoptagelser ved enkeltcelleopløsning. Vi udførte også langsgående calciumbilleddannelse af de tilsvarende neuronale undersæt ved høj spatiotemporal opløsning hos barberingsdyr. Derudover er dette præparat kompatibelt med multifotonmikroskopi og mikroskopi og udvider dermed værktøjskassen af billeddannelsesteknikker yderligere for at studere neuronale netværk på cellulære og subcellulære niveauer i barberingsmus. Vi beskrev vigtige trin og fejlfinding af protokollen. Vi drøftede også metodens mulige faldgruber og begrænsninger.

Protocol

Alle de her beskrevne metoder er blevet godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Westlake University. 1. Implant samling BEMÆRK: Samling af billedimplantatet er teknisk enkelt og kræver kun kommercielt tilgængelige genstande (Figur 1, se også Materialeoversigt). Hovedpladerne kan fremstilles på det lokale maskinværksted ved hjælp af plader i rustfrit stål eller titanium. Vi foreslår, at du forbereder et lager af fuldt samlede implantater, før operationerne påbegyndes. Når in vivo-eksperimenterne er udført, kan implantaterne genvindes og genbruges flere gange. I nogle tilfælde kan det kun kræve, at infusionsbeholderen fastgøres igen ved lodning eller udskiftning af dækglasset. Forbered alle seks nøglehardwarekomponenter til samling og installation af billedimplantater(figur 1). Figur 1: Seks vigtige hardwarekomponenter til montering og installation af billedimplantatet. (B)Vejledende kanyle. (C) Billedbehandlingskanyle. D) Glasdækselglas. (E)Hovedplade. (F)Intern kanyle. Skalalinje: 5 mm. Klik her for at se en større version af dette tal. Tænd svejsemaskinen, og varm den op til den ønskede temperatur.BEMÆRK: Temperaturen afhænger af den anvendte svejsedåse. Pudse sidefladen af billedkanylen ved hjælp af fint sandpapir for at fjerne oxidationslaget og dermed lette stærkere lodning. Billedkanylens position og injektionskanylen (føringskanyle med indsat dukkekanyle) ved hjælp af hjælpende hænder(figur 2A, B). Brug en sprøjte med en nål, påfør en lille mængde passende type flux på forbindelsespunktet mellem billeddannelse og injektion af kanyler i 5 sekunder, og fjern derefter dråben.BEMÆRK: Til dette præparat brugte vi en kommercielt tilgængelig flux, der er specificeret af producenten til at være til lodning af rustfri ståldele, da billed- og infusionskanyler er lavet af rustfrit stål. I tilfælde af andre materialer, der anvendes til fremstilling af kanyler, bør slutbrugeren vælge flux, der kan svejse det valgte materiale. Smelt loddeformen, og påfør den på forbindelsesstedet behandlet med flux (figur 2).BEMÆRK: Undgå overskydende loddeform, da det vil kræve unødvendig større kraniotomi under operationen. Figur 2: Skematisk samling af injektionskanyle, bestående af guidekanyle med indsat dukkekanyle, med billedkanylen. (A) Vinklen mellem injektionskanylen og billedkanylen skal være ca. 45 grader. (B) Spidsen af injektionskanylen skal være lige på kanten af billedkanylen. (C) En passende størrelse af den svejsedåse, der anvendes til loddebilleddannelse og injektionsbeholdere (rød linje angiver omridset af tindråben). (D) Uhensigtsmæssig størrelse af svejseformen, som bør undgås under implantatforberedelse (rød linje angiver omridset af tindråben). Klik her for at se en større version af dette tal. Vent på, at loddeformen køler af. Normalt tager det flere sekunder. Bekræft, at injektionsbeholderen ikke er blokeret ved at indsætte dukkenågen fra begge retninger. Påfør UV-hærdende optisk klæbemiddel på bunden af billedbeholderen ved hjælp af en tandstikker eller 26 G sprøjtenål. Brug en fin pincet til forsigtigt at placere et dækglas af samme størrelse som billedkanylen.BEMÆRK: Placeringen af glasset skal ske præcist på billedkanylen uden at flytte glasset for meget, når det har rørt ved det optiske klæbemiddel. Ellers bliver glasset snavset, hvilket reducerer kvaliteten af billeddannelsen. Limen hærdes i mindst en time ved 350-400 nm UV-belysning fra en standard håndholdt UV-lampe.BEMÆRK: Det brugte klæbemiddel skal være optisk gennemsigtigt. Ellers vil det reducere kvaliteten af billedvinduet.ADVARSEL: Undgå hud- og øjeneksponering ved at bære UV-beskyttelsesbriller, handsker og en laboratoriekittel. Vask kanylen i 70% ethanol, lufttørre, og opbevares i en steril beholder indtil operationen.BEMÆRK: Det er meget vigtigt at holde dækglasset så rent og intakt som muligt. Det anvendte optiske klæbemiddel er kemisk stabilt i 70% ethanol. 2. Vinduesimplantation Forberedelse skridt før operationen Steriliser alle kirurgiske instrumenter i en autoklave. Forbered 1x PBS og 70% ethanol i to separate petriskåle. Valgfrit: Desinficer operationsområdet ved hjælp af UV-lys i mindst 20 minutter, før du starter den kirurgiske procedure.BEMÆRK: Hvis der arbejdes under de mest sterile forhold, vil det resultere i vellykkede og langvarige (så længe som 6 måneder) glasdækkede kranievinduer. Forurening kan resultere i reduceret vinduesgennemsigtighed eller alvorlig betændelse i de fleste tilfælde. Kirurgisk procedure Steriliser det kirurgiske område med 70% ethanol lige før operationen. Dyret vejes, og der gives en prækirurgisk dosis smertestillende subkutan i henhold til den IACUC-godkendte dyreprotokol. Bedøve en mus med isoflurane (4% for induktion, 1,5-2% for vedligeholdelse, 0,3-0,5 L/min strømningshastighed af luft). Brug en hale-knivspids og tå-knivspids teknik til at sikre dyret er fuldt bedøvet. Overhold vitale tegn på dyret, såsom åndedræt, SpO2, og puls i løbet af proceduren. Brug en trimmer eller depilatory creme til at fjerne pelsen fra bagsiden af halsen op til øjnene. Placer musen i en stereotaxisk ramme over en operationsvarmepude (vedligeholdelse af 37 °C). Fastgør hovedet med ørestænger. Skub hovedet lidt i alle retninger for at sikre, at hovedet er fastgjort fast. Påfør øjensæbning for at forhindre dyrets øjne i at tørre ud under operationen. Steriliser det kirurgiske sted med betadin efterfulgt af 70% ethanol tre gange, før du foretager et snit. Fjern huden over toppen af kraniet, begyndende med et vandret snit langs bunden af hovedet, efterfulgt af to nedskæringer i rostral retning, næsten nå øjenlågene, så to skrå nedskæringer, der konvergerer på midterlinjen. Med to sterile vatpinde skal du trække det forbindende væv samt muskulaturen på bagsiden af nakken tilbage til kraniets kanter.BEMÆRK: Prøv at undgå at beskadige blodkarrene (især dem, der er skjult i musklen) under manipulation. Påfør en dråbe lidocainopløsning (~0,1 ml) på overfladen af periosteummet i 2 minutter for at undgå overdreven smerte. Valgfrit for at reducere hjernen fra hævelse efter fjernelse af kraniet, 0,1 mL af 1% dexamethasone kan injiceres subkutan. Skrab forsigtigt hele kraniets udsatte område med en skalpel for at skabe en tør og ru overflade, der gør det muligt for lim og tandcement at klæbe bedre og dermed resultere i kronisk implantation. Placer spidsen af nålen monteret på den stereotaxiske station på bregma, sæt alle tre koordinater (AP: Anterior-Posterior; ML: Mediale-Lateral; DV: Dorsal-Ventral) som 0. Placer spidsen af nålen på lambda og se, om AP koordinaten er 0 for at bekræfte, at hovedet position er lodret, samt hvis ML koordinaten er 0 for at bekræfte hovedet er placeret vandret. Hvis ikke, justeres de tilsvarende knapper på den stereoakstiske station, indtil AP- og ML-koordinaterne begge er inden for 0,1 mm. Flyt spidsen af nålen for at finde de tilsvarende punkter for kraniotomi og markere deres positioner på kraniet ved hjælp af en fin markør. I tilfælde af implantation for hippocampus er der 4 punkter med følgende koordinater (AP: -0,68, ML: -2,0) (AP: -3,68, ML: -2,0) (AP: -2,18, ML: -0,5) og (AP: -2,18, ML: -3,5)11, samt (AP: -4,0, ML: -2,0) for det mest kaudale punkt i injektionsbeholderen.BEMÆRK: Den markør, der anvendes i dette trin, skal steriliseres ved hjælp af UV-belysning i mindst en time før operationen. Koordinaterne vist her er for 6-8 uger gamle C57BL/6J mus. Koordinaterne kan variere på grund af forskellige aldre eller stammer af mus. Tegn en cirkel baseret på fire markerede punkter samt konturen af injektionskantaområdet på cirklens kaudale side (Figur 3). Brug en pneumatisk boremaskine med en hastighed på 10.000 omdrejninger i minuttet for forsigtigt at “tegne” langs den kontur, der er markeret på kraniet. Bor kraniet, indtil et meget tyndt lag af knoglen er tilbage, som normalt begynder at vrikke under blid berøring i midten. Påfør en dråbe steril 1x PBS til midten af craniotomy, løft knogleklappen fra kraniet med meget tynde spids pincet eller to 26 G nåle nærmer sig fra modsatte sider.BEMÆRK: PBS hjælper med at fjerne kraniet og forhindre mulig blødning af dura12. Påfør PBS, efterfulgt af blid aspiration gennem en 26G stump nål flere gange for at rense overfladen af duraen. Fjern forsigtigt duraen, enten ved aspiration eller ved oftalmisk saks. Påfør blid sugning (~-60kPa) for at ablate cortex, samt corpus callosum over hippocampus.BEMÆRK: Cortex er ofte mere gul end corpus callosum, og corpus callosum er normalt hvidere end hippocampus. Corpus callosum er normalt let at skelne ved neuronale fibre, der går i lodrette og vandrette retninger, når de observeres fra toppen (Figur 3). Figur 3: Stereotaxiske koordinater for hippocampus placering og hjerne ablation proces. (A) Fire koordinater for kanterne af craniotomy området. (B) Komplet kraniotomiområde. (C-E) Repræsentative billeder erhvervet under operationen (til venstre) og deres skematiske diagram (højre) angiver de forskellige farver og retninger af neurale fibre af (A) Cortex (B) Corpus Callosum, og (C) Hippocampus synlig under cortex ablation. Skalalinje: 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal. Blødning på dette tidspunkt vil påvirke synligheden af hjernevævet i kraniotomien. Påfør 1x PBS, efterfulgt af blid sugning, mens du aspirerer cortex for at slippe af med blodet.BEMÆRK: Kontinuerlig blødning er uundgåelig i dette trin, og til en vis grad er kontinuerlig blødning et tegn på normalt blodtryk. I modsætning til cortex imaging vindue implantation, tilstedeværelsen af blod under det optiske vindue er acceptabelt, da det vil blive ryddet flere dage efter operationen. Indsættelse af billeddiagnostiske kanyle til det skabte hulrum så hurtigt som muligt efter ablating cortex er optimal. Hvis kraniotomien er større med <0,5 mm end billedkanylen, skal du til en vis grad redde installationen af kanylen ved at bruge ekstra Kwik Sil-forsegling, før implantatet fastgøres med SuperBond. Hvis kraniotomien er mindre med <0,5 mm end billeddiagnostiske kanyle, skal du til en vis grad redde den kirurgiske procedure ved at trimme kanten af kraniotomien ved hjælp af en fin pincet eller en øjensaks, da den resterende knogle i kanten af kraniotomi er tyndere end selve kraniet som følge af boring.BEMÆRK: Kraniotomier, der overskrider 0,5 mm, kan ikke reddes. De tilsvarende foranstaltninger i disse tilfælde bør følge opsigelsesproceduren i henhold til dyreprotokollen. Sæt forsigtigt implantatet ind i kraniotomien. Tryk fast på toppen af implantatet med den L-formede nål for at placere implantatets optiske vindue så tæt som muligt på hippocampus udsatte overflade. Påfør gentagne gange PBS på kraniet omkring implantatet efterfulgt af sugning for at fjerne blod så meget som muligt under implant indsættelse. Derefter påføres et tyndt lag Kwik Sil mellem implantatet og kraniet for at forhindre dentalcement i at trænge ind under kraniet (Figur 4). Sørg for placeringen af det optiske vindue i implantatet er lige mod hippocampus for at undgå blod eller anden væske ophobning nedenunder.BEMÆRK: Det kritiske punkt er at sikre, at billedkanylens dækglas er placeret lige mod hippocampus, hvilket kan kræve blidt tryk oven på kanylen under installation og forseglingsproces. Hvorvidt den øverste side af billeddiagnostiske kanyle er parallel med kraniet er ikke afgørende for den endelige optiske adgang, så længe det optiske vindue er placeret mod hippocampus. Ifølge cortexens gennemsnitlige tykkelse over CA1-området skal du holde den øverste overflade af billedbeholderen over kraniets overflade med ~ 0,5 mm for at lette fastgørelse af kanylen til kraniet (Figur 4). Når Kwik Sil er helbredt, som normalt ikke tager mere end ~ 1 min, anvende Super-Bond C &B jævnt på overfladen af kraniet, overfladen af Kwik-Sil, og den øverste overflade af implantatet. Når Super-Bond C &B er helbredt, anvende protese base harpiks over Super-Bond C &B, samt huden omkring snittet i begyndelsen af operationen.BEMÆRK: Alternative typer cement er tilgængelige fra flere leverandører. Følg den tilsvarende producents anvisninger. Når protesebasisharpiksen er hærdet, skal du placere hovedpladen på harpiksen omkring implantatet og gøre den koncentrisk med billedkanylen. Påfør mere protese base harpiks omkring og over hovedpladen til at fastsætte sin position. Lad det helbrede i flere minutter. Undgå at opbygge et tykt lag cement omkring kanylen for at sikre bedre adgang til billedvinduet med objektiv linse(Figur 4). Figur 4: Skematisk diagram over vinduesimplantation i (A) korona- og (B) sagittalvisning. a) hovedplade; b)Protesebasis; c)Superbond; d) Kwik-Sil; e)Billeddiagnostiske kanyler f)Injektionsbeholder; g) Loddeform. (C): Mus med det installerede implantat efter operationen. Klik her for at se en større version af dette tal. Fortynd protesen base harpiks at mindske sin viskositet, således at det kan fylde de forbehold, som er svære at nå med en applikator. Placer forsigtigt et isoleret gummibånd over vinduet for at beskytte vinduet mod mulig forurening fra dyrestrøelse. Når operationen er færdig, injicere anti-inflammatorisk stof subkutant for at forhindre en inflammatorisk reaktion. Placer dyret i et varmt bur, indtil det kommer sig efter anæstesi. Kontroller musens sundhedstilstand i 72 timer efter operationen ved at observere generel adfærd. Antiinflammatorisk lægemiddel og smertestillende injiceres subkutanly i to-tre dage efter operationen hver 24. time for at frigive smerte og reducere den inflammatoriske reaktion.BEMÆRK: Alternative overvågningsprocedurer, lægemidler og doser er mulige for postoperativ pleje, henvises til IUCAC-godkendte dyreprotokol for den nøjagtige procedure. Tjek vinduet 5-7 dage efter operationen for at observere vaskulatur under vinduet. I tilfælde af et klart vindue er dyret klar til virusinjektion. 3. Injektion af virus BEMÆRK: Virus injektion sker normalt i 5-7 dage efter operationen. Før virusinjektion skal det bekræftes, at billedvinduet er klart, og det er muligt at observere hjernens vaskulatur (Figur 5). I nogle tilfælde kan det tage op til 14-16 dage at rydde vinduet, hvilket også er acceptabelt, hvis der ikke opdages hjernebetændelse. Figur 5: Repræsentativt billede af optisk vindue (A) før og (B) efter virusindsprøjtning suppleret med FastGreen-farvestof. Pilen angiver den samme vaskulaturstruktur. Skalalinje: 1 mm. Klik her for at se en større version af dette tal. Tilsæt hurtiggrøn farvestofopløsning til virusopløsning, fortyndet til den ønskede titer, i forholdet 1:9 i et PCR-rør.BEMÆRK: Hurtigt grønt farvestof tilsættes for at lette visualiseringen af virusopløsningen under injektionen. Tilslut polyethylenrøret med sprøjten, og fyld derefter slangen med mineralsk olie ved hjælp af en sprøjtepumpe. Tilslut den indre kanyle til den anden ende af slangen, indgyd og træk mineralolien et par gange for at sikre, at den indre kanyle ikke er tilstoppet. Bedøve dyret med isoflurane (4% for induktion, 1,5-2% for vedligeholdelse, 0,3-0,5 L/min strømningshastighed af luft), fastsætte hovedet i en stereotaxic ramme over en varmepude (opretholde 37 °C), anvende øjen salve. 600 nL af virusopløsningen trækkes tilbage, at mankken kanylen fjernes, og at den indvendige kanyle, der er tilsluttet injektionssprøjten, indgydes virusset med en hastighed på 50 nL/min. i 10 minutter i alt.BEMÆRK: Kontroller, om farvestoffet er synligt gennem vinduet ved hjælp af et stereomikroskop for at bekræfte vellykket virusinjektion (Figur 5). Efter injektionen skal du holde den interne kanyle tilsluttet i 10 minutter, så virussen kan sprede sig under vinduet. Fjern forsigtigt den indvendige kanyle fra styrebeholderen og opsummer den igen med en dummy kanyle. Placer dyret i et varmt bur, indtil det kommer sig efter anæstesi.BEMÆRK: Mus er typisk klar til billeddannelse i 10-20 dage efter viral injektion. Udtryksniveau og tid afhænger af den virus serotype og promotor, der bruges til at drive genekspression. 4. Billeddannelse af vågen mus under wide-field mikroskop. BEMÆRK: Den forberedte hovedplade giver ekstraordinær stabilitet af billedimplantat og giver således mulighed for langsgående billeddannelse i vågne og barberlige mus med minimale bevægelsesartefakter. Fremkald musen med 4% isoflurane i et par minutter, fastgør hovedpladen til hovedforken, og fastgør derefter hovedforken til løbebåndet.BEMÆRK: Hovedforken og løbebåndet er tilpasset den hovedplade, der bruges i denne undersøgelse, se Støttematerialer til de tilsvarende cad-filer. Induktion af mus før hovedfiksering er valgfri, da det er muligt at vænne dyr til denne procedure. Flyt løbebåndet under mikroskopet fase og placere det optiske vindue under objektiv linse. Brug en lav forstørrelse objektiv linse til at finde det bedste synsfelt (FOV) for funktionel billedbehandling, derefter skifte til en højere NA objektiv linse til at registrere neuronale aktiviteter på enkelt-celle opløsning.BEMÆRK: Hvis injektionsbeholderen stadig er en hindring for, at den objektive linse kan nå sin arbejdsafstand, skal du bruge en trådklipper til at afskære injektionsbeholderen fra hovedpladen.

Representative Results

In vivo-billeddannelse af neuronal aktivitet ved hjælp af en genetisk kodet calciumindikator. I gennemsnit starter in vivo-billeddannelse 3-4 uger efter implantation, hvis der opnås et tilstrækkeligt transgenekspressionsniveau. På dette tidspunkt er cerebral ødem og blødning normalt helt løst, og hjernevakulature kan let observeres gennem det optiske vindue. Her brugte vi den beskrevne forberedelse til at udføre de gentagne optagelser af neuronal aktivitet i den dorsale hippocampale CA1-region i barbering mus under fluorescens wide-field mikroskop. For at registrere neuronal aktivitet brugte vi en lys genetisk kodet calciumindikator, kaldet NCaMP713, som udviser lignende calciumfølsomhed og tidsmæssig opløsning som GCaMP6s14. For at udtrykke NCaMP7-indikatoren i hippocampus injicerede vi rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-viruset ved hjælp af en infusionskanyle og indledte længdebilledbilleddannelse ved 14 dage efter injektionen. For at registrere neuronal aktivitet brugte vi en 10x NA 0,3 luftmållinse og Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera, der tillod billeddannelse ved ~ 1,5×1,5 mm FOV ved op til 100 Hz frekvens. Grøn fluorescens var begejstret for en kommercielt tilgængelig 470 nm LED ved hjælp af en standard GFP filter sæt. Den gennemsnitlige billeddybde opnået i grøn kanal er ca. 50-120 μm, hvilket gør det muligt at registrere neuronal aktivitet hovedsageligt i stratum oriens og stratumpyramid. Billeddybden i nær-infrarøde kanaler kan være op til 200 μm nå de dybere lag af hippocampus8. Den gennemsnitlige optagelsestid pr. FOV var 6-12 min. Figur 6: Registrering af neuronal aktiviteten i hippocampalneuronerne ved hjælp af en grøn fluorescens, der er genetisk kodet calciumindikator. (A) En udvalgt FOV afbildet under et bredfelts fluorescensmikroskop i grøn kanal. (B) De 15 ROI’er, der svarer til de enkelte neuroner, der er vist i A og udvalgt ved hjælp af standardafvigelsesfremskrivningen af hele registreringen. (C) Repræsentative fluorescens enkeltforsøg spor af de 15 udvalgte neuroner i B. (D) En repræsentativ zoom-in visning af 2 calcium spor vist i tilsvarende farve bokse vist i C. Scale bar, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. For at opnå fluorescensspor blev de interesseregioner (ROI’er), der svarer til neuronale somas, segmenteret manuelt og analyseret af ImageJ-software. Forud for billedanalyse bevægelse korrektion, fælles post-optagelse procedurer i vågen dyr var ikke påkrævet, da de erhvervede datasæt ikke udviser bevægelse artefakter på grund af den høje stabilitet billeddannelse implantat. En repræsentativ optisk optagelse af neuronale aktiviteter fra hippocampus i en vågen barbermus præsenteres i figur 6. 15 ROI’er svarende til neuronale somas blev udvalgt manuelt fra samme FOV, der er vist i figur 6B, og fluorescenssporene for enkeltforsøg inden for hvert investeringsafkast er vist i figur 6C. Figur 6D viser to repræsentative dele af fluorescensspor fra to forskellige ROI’er. Vi udførte 4 på hinanden følgende billedbehandlingssessioner for den samme FOV med 3-dages intervaller. Det var muligt at identificere og afbilde de samme neuroner i visse FOV’er i mindst to uger (de længere billedbehandlingssessioner blev ikke udført til denne undersøgelse, men det samme præparat har været brugt i op til 6 måneder lange billeddiagnostiske undersøgelser hos mus tidligere7; Figur 7). I denne undersøgelse brugte vi AAV/DJ-CAG vektor, som drev et stærkt udtryk for det pågældende gen selv 21 dage efter viruslevering (Supplerende figur 1). Det kontinuerlige udtryk komplicerede langsigtet identifikation af de samme neuroner på grund af øget fluorescensbaggrund og udseende af nye neuroner, der udtrykker calciumindikatoren. Derfor bør udvælgelse af AAV-serotypen og promotoren til at drive målgenudtryk være en af de vigtige overvejelser under eksperimentelt design, især hvis der kræves langsgående billeddannelse af den samme delmængde neuroner. Billedkvaliteten gjorde det muligt at løse proksimale dendritter samt visualisere blodkar. Figur 7: Billedsekvens af fire forskellige FOV’er fra hippocampalområdet sporet over 12 dage. Dyret blev implanteret med vinduet på dag 0 og blev injiceret med rAAV/DJ-CAG-NCaMP7-virus på dag 7. Pilespidser indikerer neuron spores i FOV. Skalalinjer: 80 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. In vivo billeddannelse af neuronal aktivitet ved hjælp af en genetisk kodet spændingssensor.I denne undersøgelse brugte vi også en ny genetisk kodet spændingssensor ved navn SomArchon7, som giver mulighed for spændingsbilleddannelse med enkeltcellet enkelt-spike opløsning i barberingsdyr7,8. For at udtrykke SomArchon injicerede vi rAAV/DJ-CAG-SomArchon-virus ved hjælp af en infusionskanyle og udførte spændingsbilleddannelse i en hovedfast barbermus flere dage efter injektionen. For at registrere neuronal aktivitet brugte vi et 40x NA 0,8 objektiv linse og Hamamatsu OrcaFusion sCMOS-kamera, der gjorde det muligt for os at afbilde 150×40 μm FOV med op til 830 Hz erhvervelseshastighed. GFP-proteinet, som en del af SomArchon konstruerer for at lette visualisering af udtryk i det synlige område af spektret, kan let afbildes i den grønne kanal (LED-excitation ved 470/20 nm, emission 525/50 nm) for at finde celler af interesse for spændingsbilleddannelse. Optiske spændingsregistreringer blev udført i den nær-infrarøde kanal (laser excitation 637 nm ved 3,4 W/mm2,emission 665 nm lang pass) med 4 x 4 binning ved 830 Hz anskaffelseshastighed. Vi registrerede den spontane aktivitet af en hippocampal neuron i en vågen mus med gennemsnitlig SNR på 7 pr. Handlingspotentiale(Figur 8). Figur 8: Registrering af neuronal aktivitet i hippocampal neuroner ved hjælp af en nær-infrarød fluorescens genetisk kodet spænding indikator SomArchon. (A) En udvalgt FOV afbildet under wide-field fluorescens mikroskop i nær-infrarød kanal. (B) Fluorescensspor af neuronen i A. (C) Et repræsentativt zoom-in-billede af spændingssporet i den tilsvarende boks vist i B. Skalabjælke: 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. histologiEfter funktionel billeddannelse undersøgelse er færdig, post mortem analyse bruges til at bekræfte den korrekte placering af implantatet, området for virus udtryk, og lokalisering af et protein af interesse i afbildede neuroner. Til histologisk verifikation af virusudtryk og placering af implantatet blev koronale dele af PFA’s faste hjerne undersøgt under et fluorescens wide-field mikroskop (Figur 9A, C). Et konfokalt mikroskop blev brugt til at erhverve billeder i høj opløsning af individuelle neuroner, der udtrykker calciumindikatoren, samt spændingsindikatoren (Figur 9B, D). DAPI farvning blev brugt til at visualisere den samlede morfologi af hjernen skive. Derudover kan hjerneskiverne vurderes ved hjælp af immunhistokemi for at verificere astrogliose eller gliose forårsaget af vinduesimplantation og viralt udtryk. Vores tidligere undersøgelser viste, at proceduren ikke fremkaldte mærkbar gliose7. Figur 9: Histologisk verifikation af det optiske vinduesposition og virusudtryk. (A) Et repræsentativt fluorescerende billede af koronasektionens hjerneskive, der viser placeringen af det optiske vindue fra en NCaMP-udtrykkende mus. Skalabjælke: 1 mm. (B) Et repræsentativt konfokalt billede af neuroner, der udtrykker NCaMP7-indikatorerne. Skalalinje: 25 μm. (C) Et repræsentativt fluorescensbillede af koronasektionens hjerneskive, der viser placeringen af det optiske vindue fra en SomArchon-udtrykkende mus. Skalabjælke: 1 mm. (D) Et repræsentativt konfokalt billede af neuroner, der udtrykker SomArchon-indikatorerne. Skalalinje: 25 μm. Klik her for at se en større version af dette tal. Supplerende figur 1:Kvantitativ analyse af relativ fluorescensintensitet sammen med ekspressionstiden. Klik her for at hente denne fil.

Discussion

Her beskriver vi en metode til langsigtet billeddannelse af hippocampus CA1-regionen i barbering mus. Metoden er baseret på kronisk implantation af et skræddersyet billedvindue, som også muliggør målrettet administration af vira eller lægemidler direkte til neuronerne af interesse. Denne protokol består af fire hoveddele: i) samling af billedimplantater; ii) installation af billedimplantat; iii) virusinjektion via billedimplantat iv) funktionel billeddannelse hos barbermus. Nedenfor beskriver og diskuterer vi vigtige trin i protokollen, fejlfinding, ændringer og begrænsninger af metoden. Vi diskuterer også betydningen af metoden og dens potentielle alternative applikationer.

Der er flere kritiske trin i den beskrevne protokol, der er ret vigtige for en vellykket operation: (i) forberedelse af et billedimplantat af høj kvalitet; — sterile kirurgiske tilstande — cortex-aspiration — præcis placering af billedimplantatet v) virusinjektion. Som trin 1.6 indikerer, ville overskydende loddeform kræve en større kraniotomi og dermed øge risikoen for betændelse. Det er også meget vigtigt at anvende en passende mængde klæbende optisk lim, når dækglasset fastgøres til billedkanylen, som angivet i trin 1.11, da en utilstrækkelig mængde kan resultere i lækage af cerebrospinalvæske i billedkanylen og gøre den uigennemsigtig. På den anden side kan overskydende optisk klæbemiddel resultere i nedsat gennemsigtighed i glasvinduet. Mulig kontaminering af billedimplantatet kan forårsage en aktiv spredning af bindevæv under det optiske vindue og/eller alvorlig betændelse, hvilket vil føre til tidlig afslutning af forsøget. Derfor er billedbehandling implantat samling og forberedelse før operationen er næsten lige så vigtig som den kirurgiske procedure selv.

Under operationen ablated den del af cortex under craniotomy af blid aspiration, hvilket resulterer i uundgåelig blødning. Blod på det kirurgiske sted reducerer synligheden af hjernevævet, der skal fjernes, betydeligt. Dette komplicerer den præcise vurdering af den krævede dybde af vævsabblation. Omhyggelig skylning af det kirurgiske sted med PBS hver gang, før du anvender suge til at fjerne den næste del af væv giver bedre kontrol over dybden. Hjernevævet bør altid fjernes i små portioner trin-for-trin, der bekræfter dybden af ablated væv, før du fortsætter med mere sugning. Finere kontrol af sugning kan også opnås med en tyndere stump nål. Vi foreslår at bruge en 26 G nål, men mindre end 26 G diameter er mere tilbøjelige til tilstopning. Desuden tager det normalt masser af praksis at bestemme den præcise dybde af aspiration, der kræves for hvert dyr, da farven på cortex, corpus callosum og hippocampus kan variere fra mus til mus (Figur 3).

Indføring og sikring af billedimplantatet bør gøres meget præcist for at sikre den tættest mulige placering af billedvinduet til hippocampus’ dorsale overflade. Størrelsen af den forberedte craniotomy skal nøje matche implantatet og tillade indsættelse uden væsentlig modstand. Samtidig bør der ikke være nogen synlig kløft mellem kraniet og implantatet for at sikre korrekt forsegling og undgå eksponering af hjernevæv. Blidt og stabilt tryk skal påføres toppen af implantatet under forseglingen til kraniet. Det er næsten uundgåeligt at have blod under billedvinduet under implantatinstallationen. Hvis den kirurgiske procedure udføres korrekt, skal vinduet rydde ud om 3-7 dage, og hjernevakulaturen bliver tydeligt synlig. Det er også vigtigt at sikre, at virus injiceres korrekt under vinduet. I tilfælde af mislykket udtryk kan virus injiceres flere gange.

Den største komplikation, vi stødte på i nogle tilfælde, er reduceret synlighed af billedvinduet. Der er flere mulige årsager til dårlig billedkvalitet: i) vedvarende inflammation; ii) udvækst af bindevæv på glasset iii) stor kløft mellem vinduet og hippocampus. Inflammation er normalt forårsaget af forurening under operationen eller ved ikke korrekt steriliseret billeddannelse implantat. Vi foreslår autoklavering af de kirurgiske instrumenter før og efter hver operation, desinficere operationsområdet lige før proceduren og bære rent personlige værnemidler under operationen. Billedimplantater skal rengøres efter montering, sterilisering og opbevares under sterile forhold. Udvæksten af bindevæv på glasset af billeddiagnostiske implantat kan skyldes mekanisk forurening på overfladen af glasset eller overdreven traumer af hjernevævet under cortex ablation. Efter samling af implantatet er det vigtigt at bekræfte, at glasoverfladen er ren og glat. Alle stykker beskadiget hjernevæv skal også fjernes forsigtigt, før der indsættes billedimplantat i kraniotomien. I visse tilfælde resulterer kløften mellem glasvinduet og hippocampus i akkumulering af cerebrospinalvæske, hvilket reducerer kvaliteten af billeddannelse. Derfor er det under implantatinstallationen afgørende at indsætte det hele vejen for at sikre god kontakt mellem hippocampus og glasvindue. Nogle gange er det svært at identificere den nøjagtige årsag til uigennemsigtige billedbehandling vindue. Vi foreslår, at du udfører post mortem-analyse for at afsløre forhold under det optiske vindue og tilsvarende justere efterfølgende operationer.

Metoden har flere grundlæggende og tekniske begrænsninger, som bør tages i betragtning før og under in vivo-billeddannelse. En af de største begrænsninger er cortex ablation. En del af den visuelle og sensoriske cortex fjernes under operationen. Selv om det er svært at præcist at vurdere virkningen af cortex ablation, som fjernet hjernevæv ikke direkte projekt på hippocampus, flere undersøgelser viste ingen mærkbar svækkelse af hippocampal-afhængige læring eller andre relevante hippocampus funktioner^15,16. De optiske begrænsninger bør også overvejes, især når der anvendes objektive NA-objektiver. For eksempel brugte vi i denne undersøgelse en 1,75 mm lang kanyle med en 1,9 mm indvendig diameter. Geometrien af denne kanyle vil ikke bevare den fulde NA af luft mål med NA mere end ~ 0,5 eller vand mål med NA mere end ~ 0,6, da det vil klippe nogle af lys. En anden begrænsning, fælles for alle hjernescanning implantater, er, at en del af hjernen bliver udsat, og dermed fremme varmetab^17,18. Fysiologisk hjernetemperatur kan dog let genoprettes under billeddannelse ved perfusion af en varm buffer.

Den beskrevne metode kan let ændres eller justeres til andre applikationer. For eksempel kan præparatet tilpasses til billeddannelse af striatum⁷. Da striatum lægger lidt dybere end hippocampus, bør den længere billeddiagnostiske kanyle bruges til samling af billedimplantat. Vi foreslår at bruge 2,0 mm billedkanyle. Kraniets koordinater skal justeres tilsvarende (AP: +0,8 mm, ML: −1,8 mm). Derudover giver virusinjektion via infusionskanyle mulighed for at opnå ekspressionen af en transgen i et tyndt lag neuroner, når du bruger AAV serotype med begrænset spredning^19,20. Det er især gavnligt for en-foton billeddannelse på grund af reduceret out-of-fokus fluorescens fra dybere lag og som følge heraf forbedret enkelt-celle opløsning billeddannelse. Desuden kan injektionskanyle også bruges under funktionel billeddannelse til administration af lægemidler eller andre kemikalier direkte på neuronerne i FOV (Figur 5B). Samlet infusion kanyle tilføjer nyttige funktionaliteter til billeddannelse implantat, forbedre billedbehandling kvalitet på grund af den målrettede virale udtryk og muliggør farmakologisk stimulation af neuroner i FOV. Den brugte hovedplade giver ekstraordinær stabilitet af billedimplantat, der minimerer bevægelsesartefakter selv i aktivt bevægelige dyr på et løbebånd. Hovedpladen er lille og let, forårsager minimal ubehag for dyr og forbliver stabil i flere måneder efter installationen. Billedimplantatet er også kompatibelt med multifoton imaging^15,16,21 og kan kombineres med mikroskoper^22,23. En lignende billeddannelse implantat blev også brugt til multiphoton billeddannelse af de dybere hippocampus strukturer, herunder stratum radiatum, stratum lacunose, og dentate gyrus^{16,24,25,26,27}. Målretning af de dybere hippocampusstrukturer med AAV’er via infusionskanyle kan dog kræve yderligere optimering af AAV-serotypen og volumen¹⁹.

Vi mener, at den beskrevne protokol vil lette undersøgelser, der har til formål at undersøge neuronal aktivitet med høj spatiotemporal opløsning i hippocampus af barbering mus ved hjælp af enkle og overkommelige one-photon imaging opsætninger.

Materials

Cover glass	Deckgläser	72296-03
denture base resin	ShangHai New Centery Dentel Material	N/A	Type I, self-solidifying
Dummy Cannula	RWD Life Science Co.,LTD	62102	OD 0.30mm
Guide Cannula	RWD Life Science Co.,LTD	62003	26G
Head Fork	N/A	N/A	Custom made
Head Plate	N/A	N/A	Custom made
Imaging Cannula	N/A	N/A	Custom Made; OD 3mm, ID 2.7mm, Height 1.8mm, #108 stainless steel
Internal Cannula	RWD Life Science Co.,LTD	62203	0.30*0.14 (OD*ID, mm)
Kwik Sil	World Precision Instruments	KWIK-SIL
SuperBond C&B	SUN MEDICAL	N/A	SuperBond C&B kit
Treadmill Kit	N/A	N/A	Custom made
UV-cured Adhesive	NORLAND PRODUCTS	NOA 60