מסכי רעילות באורגנואידים ברשתית אנושית לגילוי תרופות
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול שלב אחר שלב ליצירת אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים ומשתמשים בהם בבדיקת רעילות קולטני אור כדי לזהות מועמדים תרופתיים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).
Abstract
אורגנואידים מספקים פלטפורמה מבטיחה לחקר מנגנונים וטיפולים במחלות, ישירות בהקשר של רקמה אנושית עם הרבגוניות והתפוקה של תרבית תאים. אורגנואידים רשתית אנושיים בוגרים משמשים לסינון טיפולים תרופתיים פוטנציאליים למחלת רשתית ניוונית הקשורה לגיל טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג 2 (MacTel).
לאחרונה הראינו כי MacTel יכול להיגרם על ידי רמות גבוהות של מין שומנים לא טיפוסי, deoxysphingolipids (deoxySLs). שומנים אלה רעילים לרשתית ועלולים לגרום לאובדן קולטני האור המתרחש בחולי מקטל. כדי לסנן תרופות על יכולתן למנוע רעילות של קולטני אור deoxySL, יצרנו אורגנואידים של רשתית אנושית מקו תאי גזע פלוריפוטנטיים שאינם מושרים על ידי מקטל (iPSC) והבשלנו אותם לגיל פוסט-מיטוטי שבו הם מפתחים את כל התאים שמקורם בשושלת העצבית של הרשתית, כולל פוטורצפטורים בוגרים מבחינה תפקודית. אורגנואידי הרשתית טופלו במטבוליט deoxySL ואפופטוזיס נמדד בתוך שכבת הפוטורצפטור באמצעות אימונוהיסטוכימיה. באמצעות מודל רעילות זה, נבדקו תרכובות פרמקולוגיות המונעות מוות של קולטני אור הנגרמים על ידי deoxySL. באמצעות גישה מועמדת ממוקדת, קבענו כי פנופיברט, תרופה הנרשמת בדרך כלל לטיפול בכולסטרול גבוה וטריגליצרידים, יכולה גם למנוע רעילות deoxySL בתאי הרשתית.
מסך הרעילות זיהה בהצלחה תרופה שאושרה על ידי ה-FDA ויכולה למנוע מוות של קולטני אור. זהו ממצא מעשי ישירות בשל המודל הרלוונטי מאוד למחלה שנבדק. ניתן לשנות פלטפורמה זו בקלות כדי לבדוק כל מספר של גורמי לחץ מטבוליים והתערבויות פרמקולוגיות פוטנציאליות לגילוי טיפול עתידי במחלות רשתית.
Introduction
מידול מחלות אנושיות בתרביות תאים ובמודלים של בעלי חיים סיפק כלים שלא יסולא בפז לגילוי, שינוי ותיקוף של טיפולים פרמקולוגיים, ואפשר להם להתקדם מתרופה מועמדת לטיפול מאושר. למרות ששילוב של מודלים במבחנה ומודלים לא אנושיים in vivo הוא כבר זמן רב מרכיב קריטי בצנרת פיתוח התרופות, הם לעתים קרובות נכשלים בחיזוי הביצועים הקליניים של תרופות מועמדות חדשות1. יש צורך ברור בפיתוח טכנולוגיות שיגשרו על הפער בין מונוקולטורה תאית אנושית פשטנית לבין ניסויים קליניים. ההתקדמות הטכנולוגית האחרונה בתרביות רקמה תלת-ממדיות המאורגנות באופן עצמי, אורגנואידים, שיפרה את נאמנותן לרקמות שהן מדגימות והפכה אותן לכלים מבטיחים בצנרת פיתוח התרופות הפרה-קליניות2.
יתרון מרכזי של תרבית תאים אנושית על פני מודלים שאינם אנושיים in vivo הוא היכולת לשכפל את המורכבויות הספציפיות של חילוף החומרים האנושי, אשר יכול להשתנות במידה ניכרת אפילו בין חולייתנים מסדר גבוה יותר, כגון בני אדם ועכברים3. עם זאת, ספציפיות זו יכולה להיות מאפילה על ידי אובדן מורכבות רקמות; כזה הוא המקרה של רקמת רשתית שבה סוגי תאים מרובים שזורים זה בזה באופן מורכב ויש להם יחסי גומלין מטבוליים סימביוטיים ייחודיים בין תת-סוגים תאיים שלא ניתן לשכפל במונוקולטורה4. לאורגנואידים אנושיים, המספקים פקסימיליה של רקמות אנושיות מורכבות עם נגישות ומדרגיות של תרביות תאים, יש פוטנציאל להתגבר על הליקויים של פלטפורמות מידול מחלות אלה.
אורגנואידים ברשתית שמקורם בתאי גזע הוכיחו את עצמם כנאמנים במיוחד במידול הרקמה המורכבת של הרשתית העצבית האנושית5. זה הפך את מודל אורגנואיד הרשתית לטכנולוגיה מבטיחה לחקר וטיפול במחלות רשתית 6,7. עד כה, רוב מידול המחלה באורגנואידים ברשתית התמקד במחלות רשתית מונוגניות, שבהן אורגנואידים ברשתית נגזרים מקווי iPSC עם וריאנטים גנטיים גורמי מחלה7. בדרך כלל מדובר במוטציות חודרניות מאוד המתבטאות בפנוטיפים התפתחותיים. פחות עבודה נעשתה ביעילות על מחלות הזדקנות שבהן מוטציות גנטיות וגורמי עקה סביבתיים משפיעים על רקמות שהתפתחו באופן תקין. מחלות נוירודגנרטיביות של הזדקנות יכולות להיות בעלות תורשה גנטית מורכבת ותרומות מגורמי עקה סביבתיים שמטבעם קשה למדל באמצעות תרביות תאים לטווח קצר. עם זאת, במקרים רבים מחלות מורכבות אלה יכולות להתגבש על גורמי עקה תאיים או מטבוליים נפוצים, אשר, כאשר נבדקים על רקמה אנושית מפותחת, יכולים לספק תובנות רבות עוצמה על מחלות נוירודגנרטיביות של הזדקנות8.
המחלה הניוונית המקולרית המאוחרת, טלנגיאקטזיה מקולרית מסוג II (MacTel), היא דוגמה מצוינת למחלה נוירודגנרטיבית מורכבת גנטית המתלכדת על פגם מטבולי נפוץ. מקטל היא מחלה ניוונית נדירה ברשתית של הזדקנות הגורמת לאובדן קולטני אור וגליה Müller במקולה, מה שמוביל לאובדן פרוגרסיבי בראייה המרכזית 9,10,11,12,13. ב- MacTel, תורשה גנטית לא מוגדרת, אולי רב-גורמית, מניעה ירידה נפוצה בסרין במחזור הדם בחולים, וכתוצאה מכך עלייה במין שומנים נוירוטוקסיים הנקראים deoxysphingolipids (deoxySL)14,15. כדי להוכיח שהצטברות של deoxySL רעילה לרשתית ולאמת טיפולים תרופתיים פוטנציאליים, פיתחנו פרוטוקול זה כדי להעריך רעילות של קולטני אור באורגנואידים ברשתית אנושית14.
כאן אנו מתארים פרוטוקול ספציפי להבחנה בין אורגנואידים ברשתית אנושית, ביסוס בדיקת רעילות והצלה באמצעות אורגנואידים, וכימות תוצאות. אנו מספקים דוגמה מוצלחת שבה אנו קובעים את הרעילות הספציפית לרקמות של גורם חשוד כגורם מחלה, deoxySL, ומאמתים את השימוש בתרופה גנרית בטוחה, פנופיברט, לטיפול פוטנציאלי ברעילות רשתית הנגרמת על ידי deoxySL. עבודות קודמות הראו כי פנופיברט יכול להגביר את השפלה של deoxySL ולהוריד את deoxySL במחזור הדם בחולים, עם זאת, יעילותו בהפחתת רעילות הרשתית הנגרמת על ידי deoxySL לא נבדקה16,17. למרות שאנו מציגים דוגמה ספציפית, פרוטוקול זה יכול לשמש להערכת ההשפעה של כל מספר של גורמי עקה מטבוליים/סביבתיים ותרופות טיפוליות פוטנציאליות על רקמת הרשתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
וריאציות של פרוטוקול בידול
מאז המצאת הכוסות האופטיות היוצרות את עצמן על ידי קבוצת20 של יושיקי סאסאי, מעבדות רבות פיתחו פרוטוקולים ליצירת אורגנואידים ברשתית שיכולים להשתנות כמעט בכל שלב 5,18,19,21. ר?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
נתמך על ידי מכון המחקר הרפואי לואי. ברצוננו להודות למשפחת לואי על תמיכתה בפרויקט מקטל. ברצוננו להודות למרי גאנטנר, מייק דורל ולאה שפקה על תרומתם האינטלקטואלית ועזרתם בהכנת כתב היד.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
References
- Waring, M. J., et al. An analysis of the attrition of drug candidates from four major pharmaceutical companies. Nature Review Drug Discovery. 14 (7), 475-486 (2015).
- Khalil, A. S., Jaenisch, R., Mooney, D. J. Engineered tissues and strategies to overcome challenges in drug development. Advances in Drug Delivery Reviews. 158, 116-139 (2020).
- Demetrius, L. Of mice and men. When it comes to studying ageing and the means to slow it down, mice are not just small humans. EMBO Reports. , 39-44 (2005).
- Lindsay, K. J., et al. Pyruvate kinase and aspartate-glutamate carrier distributions reveal key metabolic links between neurons and glia in retina. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111 (43), 15579-15584 (2014).
- Cowan, C. S., et al. Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution. Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).
- Kruczek, K., Swaroop, A. Pluripotent stem cell-derived retinal organoids for disease modeling and development of therapies. Stem Cells. 38 (10), 1206-1215 (2020).
- Sinha, D., Phillips, J., Phillips, M. J., Gamm, D. M. Mimicking retinal development and disease with human pluripotent stem cells. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 57 (5), 1-9 (2016).
- Gan, L., Cookson, M. R., Petrucelli, L., La Spada, A. R. Converging pathways in neurodegeneration, from genetics to mechanisms. Nature Neuroscience. 21 (10), 1300-1309 (2018).
- Aung, K. Z., Wickremasinghe, S. S., Makeyeva, G., Robman, L., Guymer, R. H. The prevalence estimates of macular telangiectasia type 2: the Melbourne collaborative cohort study. Retina. 30 (3), 473-478 (2010).
- Chew, E. Y., et al. Effect of ciliary neurotrophic factor on retinal neurodegeneration in patients with macular telangiectasia type 2: A randomized clinical trial. Ophthalmology. 126 (4), 540-549 (2019).
- Gass, J. D., Blodi, B. A. Idiopathic juxtafoveolar retinal telangiectasis. Update of classification and follow-up study. Ophthalmology. 100 (10), 1536-1546 (1993).
- Klein, R., et al. The prevalence of macular telangiectasia type 2 in the Beaver Dam eye study. American Journal of Ophthalmology. 150 (1), 55-62 (2010).
- Powner, M. B., et al. Loss of Muller’s cells and photoreceptors in macular telangiectasia type 2. Ophthalmology. 120 (11), 2344-2352 (2013).
- Gantner, M. L., et al. Serine and lipid metabolism in macular disease and peripheral neuropathy. New England Journal of Medicine. 381 (15), 1422-1433 (2019).
- Scerri, T. S., et al. Genome-wide analyses identify common variants associated with macular telangiectasia type 2. Nature Genetics. 49 (4), 559-567 (2017).
- Alecu, I., et al. Cytotoxic 1-deoxysphingolipids are metabolized by a cytochrome P450-dependent pathway. Journal of Lipid Research. 58 (1), 60-71 (2017).
- Othman, A., et al. Fenofibrate lowers atypical sphingolipids in plasma of dyslipidemic patients: A novel approach for treating diabetic neuropathy. Journal of Clinical Lipidology. 9 (4), 568-575 (2015).
- Ohlemacher, S. K., Iglesias, C. L., Sridhar, A., Gamm, D. M., Meyer, J. S. Generation of highly enriched populations of optic vesicle-like retinal cells from human pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 32, 1-20 (2015).
- Zhong, X., et al. Generation of three-dimensional retinal tissue with functional photoreceptors from human iPSCs. Nature Communication. 5, 4047 (2014).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Wahlin, K. J., et al. Photoreceptor outer segment-like structures in long-term 3D retinas from human pluripotent stem cells. Science Reports. 7 (1), 766 (2017).
- Capowski, E. E., et al. Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines. Development. 146 (1), (2019).
- Luo, Z., et al. An optimized system for effective derivation of three-dimensional retinal tissue via Wnt signaling regulation. Stem Cells. 36 (11), 1709-1722 (2018).
- Ovando-Roche, P., et al. Use of bioreactors for culturing human retinal organoids improves photoreceptor yields. Stem Cell Research Therapy. 9 (1), 156 (2018).
