用于药物发现的人视网膜类器官毒性筛选

Summary

在这里，我们提出了一个分步方案来生成成熟的人视网膜类器官，并在光感受器毒性测定中利用它们来确定年龄相关性视网膜退行性疾病黄斑毛细血管扩张症 2 型 （MacTel） 的候选药物。

Abstract

类器官为研究疾病机制和治疗提供了一个有前途的平台，直接在具有细胞培养多功能性和通量的人体组织背景下。成熟的人视网膜类器官用于筛选与年龄相关的视网膜退行性疾病黄斑毛细血管扩张症 2 型 （MacTel） 的潜在药物治疗。

我们最近表明，MacTel 可能是由非典型脂质物种脱氧鞘脂 （deoxySL） 水平升高引起的。这些脂质对视网膜有毒，并可能导致MacTel患者发生的感光器损失。为了筛选药物预防脱氧SL感光器毒性的能力，我们从非MacTel诱导的多能干细胞（iPSC）系生成了人视网膜类器官，并将它们成熟到有丝分裂后年龄，在那里它们发育出视网膜的所有神经元谱系衍生细胞，包括功能成熟的光感受器。用脱氧SL代谢物处理视网膜类器官，并使用免疫组织化学测量光感受器层内的细胞凋亡。使用该毒性模型，筛选了防止脱氧SL诱导的感光器死亡的药理化合物。使用靶向候选方法，我们确定非诺贝特（一种通常用于治疗高胆固醇和甘油三酯的药物）也可以预防视网膜细胞中的脱氧SL毒性。

毒性筛查成功鉴定出FDA批准的可以预防感光器死亡的药物。由于测试了高度相关的疾病模型，这是一个直接可操作的发现。该平台可以轻松修改，以测试任意数量的代谢应激源和潜在的药物干预，以用于视网膜疾病的未来治疗发现。

Introduction

在细胞培养和动物模型中对人类疾病进行建模为发现、修改和验证药物治疗提供了宝贵的工具，使他们能够从候选药物发展到批准的治疗。尽管体外和非人体体内模型的组合长期以来一直是药物开发管道的关键组成部分，但它们经常无法预测新型候选药物的临床性能¹。显然需要开发技术，弥合简单的人类细胞单一培养和临床试验之间的差距。自组织三维组织培养物类器官的最新技术进步提高了它们对模型组织的保真度，使其成为临床前药物开发管道中的有前途的工具²。

与非人类体内模型相比，人类细胞培养的一个主要优势是能够复制人类新陈代谢的特定复杂性，即使在人类^和小鼠等高阶脊椎动物之间也可能有很大差异3。然而，这种特异性可能会被组织复杂性的损失所掩盖;视网膜组织就是这种情况，其中多种细胞类型错综复杂地交织在一起，并且在细胞亚型之间具有独特的共生代谢相互作用，无法在单一培养中复制⁴。人类类器官提供了复杂人体组织的传真，具有细胞培养的可及性和可扩展性，有可能克服这些疾病建模平台的缺陷。

来自干细胞的视网膜类器官已被证明在模拟人类神经视网膜的复杂组织方面特别^忠实5。这使得视网膜类器官模型成为研究和治疗视网^{膜疾病6，7}的有前途的技术。迄今为止，视网膜类器官的大部分疾病建模都集中在单基因视网膜疾病上，其中视网膜类器官来源于具有致病^{遗传变异的}iPSC系7。这些通常是高渗透性突变，表现为发育表型。在衰老疾病方面，基因突变和环境压力源影响正常发育的组织的有效工作较少。衰老的神经退行性疾病可能具有复杂的遗传和环境压力源的贡献，这些环境应激源本质上很难使用短期细胞培养物进行建模。然而，在许多情况下，这些复杂的疾病可以结合在共同的细胞或代谢应激源上，当在完全发育的人体组织上进行测试时，^{可以为衰老的}神经退行性疾病提供强有力的见解8。

迟发性黄斑退行性疾病，黄斑毛细血管扩张II型（MacTel），是一种遗传性复杂的神经退行性疾病的一个很好的例子，它融合在一个常见的代谢缺陷上。MacTel 是一种罕见的视网膜衰老退行性疾病，导致黄斑中光感受器和穆勒胶质细胞丢失，导致中心视力进行性丧失⁹，10，¹¹，^12，13。在MacTel中，一种未确定的，可能是多因素的遗传导致患者循环丝氨酸的共同减少，导致称为脱氧鞘脂（deoxySL）的神经毒性脂质种类增加^14，15。为了证明脱氧SL的积累对视网膜有毒并验证潜在的药物治疗，我们开发了该协议来测定人视网膜类器官中的光感受器毒性¹⁴。

在这里，我们概述了用于区分人视网膜类器官，使用类器官建立毒性和救援测定以及量化结果的特定方案。我们提供了一个成功的例子，我们确定了可疑致病剂deoxySL的组织特异性毒性，并验证了使用安全的仿制药非诺贝特来治疗脱氧SL诱导的视网膜毒性。先前的工作表明，非诺贝特可以增加患者脱氧SL的降解并降低循环脱氧SL，然而，其在降低脱氧SL诱导的视网膜毒性方面的功效尚未经过测试^16，17。尽管我们提出了一个具体的例子，但该协议可用于评估任何数量的代谢/环境应激源和潜在治疗药物对视网膜组织的影响。

Protocol

1. 解冻、传代和扩增 iPSC/ESC 注意：对于所有细胞培养步骤，请使用最佳实践来维持无菌细胞培养。 用基底膜基质培养基包覆 6 孔细胞培养板。要制备 1x 该培养基，请遵循产品规格或用 9 mL DMEM/F12 稀释 75 μL 冷基质培养基。在 6 孔板中每孔加入 1.5 mL 新鲜制备的 1x 培养基。在37°C孵育30分钟。 吸出基底膜基质培养基，并用 3 mL DMEM/F12 冲洗每个孔。加入 2 mL …

Representative Results

视网膜类器官由非MacTel对照iPSC系产生。类器官在培养中达到26周后，将它们选中并分成实验组。用不同浓度的脱氧SA处理类器官，以确定脱氧SA是否对光感受器有毒。测试四种浓度的脱氧SA，从0到1μM（图2），类器官处理8天，每隔一天更换一次培养基。响应脱氧SA的细胞死亡是浓度依赖性的，可在低至50nM脱氧SA中检测到（图2D）。测试的最高浓度1μM脱氧S…

Discussion

鉴别方案差异
自从Yoshiki Sasai的²⁰组发明自形成光学杯以来，许多实验室已经开发了产生视网膜类器官的方案，这些类器官几乎可以在^每一步5，^18，19，21中变化。详尽的协议列表可以在Capowski等人²²中找到。我们在这里提供的分化方案是一种简单、低?…

Materials

0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503