Toxizitätsscreens in humanen Netzhautorganoiden für die pharmazeutische Forschung

Summary

Hier stellen wir ein Schritt-für-Schritt-Protokoll vor, um reife menschliche Netzhautorganoide zu erzeugen und sie in einem Photorezeptor-Toxizitätstest zu verwenden, um pharmazeutische Kandidaten für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu identifizieren.

Abstract

Organoide bieten eine vielversprechende Plattform, um Krankheitsmechanismen und Behandlungen direkt im Kontext von menschlichem Gewebe mit der Vielseitigkeit und dem Durchsatz von Zellkulturen zu untersuchen. Reife humane Netzhautorganoide werden verwendet, um potenzielle pharmazeutische Behandlungen für die altersbedingte retinale degenerative Erkrankung Makulateleangiektasien Typ 2 (MacTel) zu untersuchen.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass MacTel durch erhöhte Konzentrationen einer atypischen Lipidspezies, der Desoxysphingolipide (DesoxySLs), verursacht werden kann. Diese Lipide sind toxisch für die Netzhaut und können den Photorezeptorverlust verursachen, der bei MacTel-Patienten auftritt. Um Medikamente auf ihre Fähigkeit zu untersuchen, die Toxizität von DesoxySL-Photorezeptoren zu verhindern, erzeugten wir humane Netzhautorganoide aus einer nicht-MacTel-induzierten pluripotenten Stammzelllinie (iPSC) und reiften sie bis zu einem postmitotischen Alter, in dem sie alle von der neuronalen Linie abgeleiteten Zellen der Netzhaut entwickeln, einschließlich funktionell reifer Photorezeptoren. Die retinalen Organoide wurden mit einem DesoxySL-Metaboliten behandelt und die Apoptose innerhalb der Photorezeptorschicht mittels Immunhistochemie gemessen. Unter Verwendung dieses Toxizitätsmodells wurden pharmakologische Verbindungen, die den DesoxySL-induzierten Photorezeptortod verhindern, untersucht. Mit einem gezielten Kandidatenansatz stellten wir fest, dass Fenofibrat, ein Medikament, das üblicherweise zur Behandlung von hohem Cholesterinspiegel und Triglyceriden verschrieben wird, auch die DesoxySL-Toxizität in den Zellen der Netzhaut verhindern kann.

Das Toxizitäts-Screening identifizierte erfolgreich ein von der FDA zugelassenes Medikament, das den Tod von Photorezeptoren verhindern kann. Dies ist aufgrund des getesteten hochgradig krankheitsrelevanten Modells ein direkt umsetzbarer Befund. Diese Plattform kann leicht modifiziert werden, um eine beliebige Anzahl von metabolischen Stressoren und potenziellen pharmakologischen Interventionen für die zukünftige Behandlungsforschung bei Netzhauterkrankungen zu testen.

Introduction

Die Modellierung menschlicher Krankheiten in Zellkultur- und Tiermodellen hat unschätzbare Werkzeuge für die Entdeckung, Modifikation und Validierung pharmakologischer Therapeutika geliefert, die es ihnen ermöglichen, vom Wirkstoffkandidaten zur zugelassenen Therapie zu gelangen. Obwohl eine Kombination von In-vitro- und nicht-humanen In-vivo-Modellen seit langem ein wichtiger Bestandteil der Arzneimittelentwicklungspipeline ist, können sie häufig nicht die klinische Leistung neuartiger Arzneimittelkandidaten vorhersagen¹. Es besteht ein klarer Bedarf an der Entwicklung von Technologien, die die Lücke zwischen vereinfachenden humanzellulären Monokulturen und klinischen Studien schließen. Jüngste technologische Fortschritte bei selbstorganisierten dreidimensionalen Gewebekulturen, Organoiden, haben ihre Treue zu den von ihnen modellierten Geweben verbessert, was sie zu vielversprechenden Werkzeugen in der präklinischen Arzneimittelentwicklungspipeline^{macht 2}.

Ein großer Vorteil der menschlichen Zellkultur gegenüber nicht-menschlichen In-vivo-Modellen ist die Fähigkeit, die spezifischen Feinheiten des menschlichen Stoffwechsels zu replizieren, die selbst zwischen Wirbeltieren höherer Ordnung wie Menschen und Mäusen erheblich variieren können³. Diese Spezifität kann jedoch durch einen Verlust der Gewebekomplexität überschattet werden; Dies ist der Fall bei Netzhautgewebe, wo mehrere Zelltypen kompliziert miteinander verwoben sind und ein einzigartiges symbiotisches metabolisches Zusammenspiel zwischen zellulären Subtypen aufweisen, das in einer Monokultur nicht repliziert werden^{kann 4}. Humane Organoide, die ein Faksimile komplexer menschlicher Gewebe mit der Zugänglichkeit und Skalierbarkeit von Zellkulturen liefern, haben das Potenzial, die Mängel dieser Krankheitsmodellierungsplattformen zu überwinden.

Aus Stammzellen gewonnene Netzhautorganoide haben sich bei der Modellierung des komplexen Gewebes der menschlichen neuralen Netzhaut als besonders zuverlässig erwiesen⁵. Dies hat das retinale Organoidmodell zu einer vielversprechenden Technologie für die Erforschung und Behandlung von Netzhauterkrankungen gemacht ^6,7. Bisher konzentrierte sich ein Großteil der Krankheitsmodellierung in Netzhautorganoiden auf monogene Netzhauterkrankungen, bei denen Netzhautorganoide von iPS-Zelllinien mit krankheitsverursachenden genetischen Varianten abgeleitet werden⁷. Dies sind im Allgemeinen hochpenetrante Mutationen, die sich als Entwicklungsphänotypen manifestieren. Weniger Arbeit wurde effektiv an alternden Krankheiten durchgeführt, bei denen genetische Mutationen und Umweltstressoren sich auf Gewebe auswirken, das sich normal entwickelt hat. Neurodegenerative Erkrankungen des Alterns können eine komplexe genetische Vererbung und Beiträge von Umweltstressoren haben, die mit Kurzzeitzellkulturen von Natur aus schwer zu modellieren sind. In vielen Fällen können diese komplexen Krankheiten jedoch auf gemeinsamen zellulären oder metabolischen Stressoren zusammentreffen, die, wenn sie an einem voll entwickelten menschlichen Gewebe getestet werden, aussagekräftige Einblicke in neurodegenerative Erkrankungen des Alterns liefern können⁸.

Die spät einsetzende degenerative Makulaerkrankung, Makulateleangiektasien Typ II (MacTel), ist ein gutes Beispiel für eine genetisch komplexe neurodegenerative Erkrankung, die auf einem gemeinsamen Stoffwechseldefekt beruht. MacTel ist eine seltene degenerative Erkrankung des Alterns der Netzhaut, die zu einem Verlust des Photorezeptors und der Müller-Glia in der Makula führt, was zu einem fortschreitenden Verlust des zentralen Sehens führt^{9,10,11,12,13}. Bei MacTel führt eine unbestimmte, möglicherweise multifaktorielle genetische Vererbung zu einer häufigen Verringerung des zirkulierenden Serins bei Patienten, was zu einem Anstieg einer neurotoxischen Lipidspezies namens Desoxysphingolipide (DesoxySL) ^führt14,15. Um zu beweisen, dass die Akkumulation von DesoxySL für die Netzhaut toxisch ist, und um potenzielle pharmazeutische Therapeutika zu validieren, haben wir dieses Protokoll entwickelt, um die Photorezeptor-Toxizität in menschlichen Netzhautorganoiden zu untersuchen¹⁴.

Hier skizzieren wir ein spezifisches Protokoll zur Differenzierung menschlicher Netzhautorganoide, zur Etablierung eines Toxizitäts- und Rettungstests unter Verwendung von Organoiden und zur Quantifizierung der Ergebnisse. Wir liefern ein erfolgreiches Beispiel, in dem wir die gewebespezifische Toxizität eines vermuteten krankheitserregenden Wirkstoffs, DesoxySL, bestimmen und die Verwendung eines sicheren Generikums, Fenofibrat, für die potenzielle Behandlung der DesoxySL-induzierten Netzhauttoxizität validieren. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Fenofibrat den Abbau von DesoxySL erhöhen und das zirkulierende DesoxySL bei Patienten senken kann, seine Wirksamkeit bei der Verringerung der DesoxySL-induzierten Netzhauttoxizität wurde jedoch nicht getestet^16,17. Obwohl wir ein konkretes Beispiel präsentieren, kann dieses Protokoll verwendet werden, um die Wirkung einer beliebigen Anzahl von metabolischen/umweltbedingten Stressoren und potenziellen therapeutischen Medikamenten auf das Netzhautgewebe zu bewerten.

Protocol

1. Auftauen, Durchlässigkeit und Expansion von iPS-Zellen/ES-Zellen HINWEIS: Verwenden Sie für alle Zellkultivierungsschritte Best Practices, um eine sterile Zellkultur zu erhalten. Beschichten Sie eine 6-Well-Zellkulturplatte mit Basalmembranmatrixmedium.Um 1x dieses Mediums herzustellen, befolgen Sie die Produktspezifikationen oder verdünnen Sie 75 μl Kaltmatrixmedium mit 9 mL DMEM/F12. 1,5 ml frisch zubereitetes 1x Medium pro Vertiefung in eine 6-Well-Platte geben. Bei…

Representative Results

Retinale Organoide wurden aus einer Nicht-MacTel-Kontroll-iPSC-Linie erzeugt. Nachdem die Organoide 26 Wochen in Kultur erreicht hatten, wurden sie ausgewählt und in Versuchsgruppen aufgeteilt. Organoide wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen von DesoxySA behandelt, um festzustellen, ob DesoxySA für Photorezeptoren toxisch ist. Es wurden vier Konzentrationen von DesoxySA von 0 bis 1 μM getestet (Abbildung 2) und Organoide wurden 8 Tage lang behandelt, wobei die Medien jeden zweiten …

Discussion

Variationen des Differenzierungsprotokolls
Seit der Erfindung selbstformender optischer Becher durch Yoshiki Sasais Gruppe²⁰ haben viele Labore Protokolle entwickelt, um Netzhautorganoide zu erzeugen, die bei fast jedem Schritt variieren können ^5,18,19,21. Eine vollständige Liste der Protokolle findet sich in Capowski et ^{al.22</sup…}

Materials

0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
125mL Erlenmeyer Flasks	VWR	89095-258
1-deoxysphinganine	Avanti	860493
B27 Supplement, minus vitamin A	Gibco	12587010
Beaver 6900 Mini-Blade	Beaver-Visitec	BEAVER6900
D-(+)-Sucrose	VWR	97061-432
DAPI	Thermo-fisher	D1306
Dispase II, powder	Gibco	17105041
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	11995073
DMEM/F12	Gibco	11330
Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555	Thermo-fisher	A32794
donkey serum	Sigma	D9663-10ML
FBS, Heat Inactivated	Corning	45001-108
Fenofibrate	Sigma	F6020
Glutamax	Gibco	35050061
Heparin	Stemcell Technologies	7980
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin	Sigma	11684795910
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
mTeSR 1	Stemcell Technologies	85850
N2 Supplement	Gibco	17502048
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Pierce 16% Formaldehyde	Thermo-fisher	28906
Rabbit anti-Recoverin antibody	Millipore	AB5585
Sodium Citrate	Sigma	W302600
Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units	MilliporeSigma	SE1M179M6
Taurine	Sigma	T0625
Tissue Plus- O.C.T. compound	Fisher Scientific	23-730-571
Tissue-Tek Cryomold	EMS	62534-10
Triton X-100	Sigma	X100
Tween-20	Sigma	P1379
Ultra-Low Attachment 6 well Plates	Corning	29443-030
Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask	Corning	3814
Vacuum Filtration System	VWR	10040-436
Vectashield-mounting medium	vector Labs	H-1000
wax pen-ImmEdge	vector Labs	H-4000
Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor)	Sigma	Y0503