फार्मास्युटिकल डिस्कवरी के लिए मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स में विषाक्तता स्क्रीन
Summary
यहां हम परिपक्व मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए एक चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और उम्र से संबंधित रेटिना अपक्षयी रोग मैकुलर टेलेंजिक्टेसिया टाइप 2 (मैकटेल) के लिए दवा उम्मीदवारों की पहचान करने के लिए फोटोरिसेप्टर विषाक्तता परख में उनका उपयोग करते हैं।
Abstract
ऑर्गेनोइड्स रोग तंत्र और उपचार का अध्ययन करने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करते हैं, सीधे सेल संस्कृति की बहुमुखी प्रतिभा और थ्रूपुट के साथ मानव ऊतक के संदर्भ में। परिपक्व मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स का उपयोग उम्र से संबंधित रेटिना अपक्षयी रोग मैकुलर टेलेंजिक्टेसिया टाइप 2 (मैकटेल) के लिए संभावित दवा उपचार को स्क्रीन करने के लिए किया जाता है।
हमने हाल ही में दिखाया है कि मैकटेल एक एटिपिकल लिपिड प्रजातियों, डीऑक्सीस्फिंगोलिपिड्स (डीऑक्सीएसएल) के ऊंचे स्तर के कारण हो सकता है। ये लिपिड रेटिना के लिए विषाक्त हैं और मैकटेल रोगियों में होने वाले फोटोरिसेप्टर हानि को चला सकते हैं। डीऑक्सीएसएल फोटोरिसेप्टर विषाक्तता को रोकने की उनकी क्षमता के लिए दवाओं की जांच करने के लिए, हमने एक गैर-मैकटेल प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (आईपीएससी) लाइन से मानव रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न किए और उन्हें पोस्ट-माइटोटिक उम्र में परिपक्व किया, जहां वे कार्यात्मक रूप से परिपक्व फोटोरिसेप्टर सहित रेटिना के सभी न्यूरोनल वंश-व्युत्पन्न कोशिकाओं को विकसित करते हैं। रेटिना ऑर्गेनोइड्स को एक डीऑक्सीएसएल मेटाबोलाइट के साथ इलाज किया गया था और एपोप्टोसिस को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके फोटोरिसेप्टर परत के भीतर मापा गया था। इस विषाक्तता मॉडल का उपयोग करते हुए, औषधीय यौगिक जो डीऑक्सीएसएल-प्रेरित फोटोरिसेप्टर मृत्यु को रोकते हैं, की जांच की गई थी। एक लक्षित उम्मीदवार दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, हमने निर्धारित किया कि फेनोफाइब्रेट, आमतौर पर उच्च कोलेस्ट्रॉल और ट्राइग्लिसराइड्स के उपचार के लिए निर्धारित दवा, रेटिना की कोशिकाओं में डीऑक्सीएसएल विषाक्तता को भी रोक सकती है।
विषाक्तता स्क्रीन ने सफलतापूर्वक एफडीए-अनुमोदित दवा की पहचान की जो फोटोरिसेप्टर मृत्यु को रोक सकती है। यह परीक्षण किए गए अत्यधिक रोग-प्रासंगिक मॉडल के कारण एक प्रत्यक्ष कार्रवाई योग्य खोज है। रेटिना रोगों में भविष्य के उपचार की खोज के लिए किसी भी संख्या में चयापचय तनाव और संभावित औषधीय हस्तक्षेप का परीक्षण करने के लिए इस मंच को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।
Introduction
सेल संस्कृति और पशु मॉडल में मानव रोग मॉडलिंग ने फार्माकोलॉजिकल चिकित्सीय की खोज, संशोधन और सत्यापन के लिए अमूल्य उपकरण प्रदान किए हैं, जिससे उन्हें उम्मीदवार दवा से अनुमोदित चिकित्सा में आगे बढ़ने की अनुमति मिलती है। यद्यपि विवो मॉडल में इन विट्रो और गैर-मानव का संयोजन लंबे समय से दवा विकास पाइपलाइन का एक महत्वपूर्ण घटक रहा है, वे अक्सर नई दवा उम्मीदवारों के नैदानिक प्रदर्शन की भविष्यवाणी करने में विफलरहते हैं। प्रौद्योगिकियों के विकास की स्पष्ट आवश्यकता है जो सरलीकृत मानव सेलुलर मोनोकल्चर और नैदानिक परीक्षणों के बीच की खाई को पाटते हैं। स्व-संगठित त्रि-आयामी ऊतक संस्कृतियों, ऑर्गेनोइड्स में हालिया तकनीकी प्रगति ने उन ऊतकों के प्रति उनकी निष्ठा में सुधार किया है जो वे उन्हें प्रीक्लिनिकल दवा विकास पाइपलाइन2 में आशाजनक उपकरण बनाते हैं।
विवो मॉडल में गैर-मानव पर मानव कोशिका संस्कृति का एक प्रमुख लाभ मानव चयापचय की विशिष्ट पेचीदगियों को दोहराने की क्षमता है जो मनुष्यों और चूहों जैसे उच्च क्रम कशेरुकियों के बीच भी काफी भिन्न होसकता है। हालांकि, इस विशिष्टता को ऊतक जटिलता में नुकसान से कम किया जा सकता है; रेटिना ऊतक के लिए ऐसा मामला है जहां कई सेल प्रकार जटिल रूप से परस्पर जुड़े हुए हैं और सेलुलर उपप्रकारों के बीच एक अद्वितीय सहजीवी चयापचय परस्पर क्रिया है जिसे मोनोकल्चर4 में दोहराया नहीं जा सकता है। मानव ऑर्गेनोइड्स, जो सेल संस्कृति की पहुंच और स्केलेबिलिटी के साथ जटिल मानव ऊतकों का एक फेसिमाइल प्रदान करते हैं, इन रोग मॉडलिंग प्लेटफार्मों की कमियों को दूर करने की क्षमता रखते हैं।
स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त रेटिना ऑर्गेनोइड्स मानव तंत्रिका रेटिना 5 के जटिल ऊतक को मॉडलिंग में विशेष रूप से वफादार साबित हुएहैं। इसने रेटिना ऑर्गेनॉइड मॉडल को रेटिना रोग 6,7 के अध्ययन और उपचार के लिए एक आशाजनक तकनीक बना दिया है। आज तक रेटिना ऑर्गेनोइड्स में अधिकांश रोग मॉडलिंग ने मोनोजेनिक रेटिना रोगों पर ध्यान केंद्रित किया है जहां रेटिना ऑर्गेनोइड्स रोग पैदा करने वाले आनुवंशिक वेरिएंट 7 के साथ आईपीएससी लाइनों से प्राप्तहोते हैं। ये आम तौर पर अत्यधिक पेनेट्रेंट उत्परिवर्तन होते हैं जो विकासात्मक फेनोटाइप के रूप में प्रकट होते हैं। उम्र बढ़ने की बीमारियों पर कम काम प्रभावी ढंग से किया गया है जहां आनुवंशिक उत्परिवर्तन और पर्यावरणीय तनाव सामान्य रूप से विकसित ऊतक को प्रभावित करते हैं। उम्र बढ़ने के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में जटिल आनुवंशिक विरासत और पर्यावरणीय तनावों से योगदान हो सकता है जो अल्पकालिक सेल संस्कृतियों का उपयोग करके मॉडल करना स्वाभाविक रूप से मुश्किल है। हालांकि, कई मामलों में ये जटिल रोग सामान्य सेलुलर या चयापचय तनावों पर एकजुट हो सकते हैं, जो पूरी तरह से विकसित मानव ऊतक पर परीक्षण किए जाने पर, उम्र बढ़ने के न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों में शक्तिशाली अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकतेहैं।
देर से शुरू होने वाली मैकुलर डीजेनेरेटिव बीमारी, मैकुलर टेलेंजीक्टेसिया टाइप II (मैकटेल), आनुवंशिक रूप से जटिल न्यूरोडीजेनेरेटिव बीमारी का एक बड़ा उदाहरण है जो एक सामान्य चयापचय दोष पर निर्भर करता है। मैकटेल उम्र बढ़ने की एक असामान्य रेटिना अपक्षयी बीमारी है जिसके परिणामस्वरूप मैक्युला में फोटोरिसेप्टर और मुलर ग्लिया हानि होती है, जिससे केंद्रीय दृष्टि 9,10,11,12,13 में प्रगतिशील नुकसान होता है। मैकटेल में, एक अनिर्धारित, संभवतः बहुक्रियात्मक, आनुवंशिक विरासत रोगियों में परिसंचारी सेरीन में एक आम कमी लाती है, जिसके परिणामस्वरूप एक न्यूरोटॉक्सिक लिपिड प्रजातियों में वृद्धि होती है जिसे डीऑक्सीस्फिंगोलिपिड्स (डीऑक्सीएसएल) 14,15 कहा जाता है। यह साबित करने के लिए कि डीऑक्सीएसएल का संचय रेटिना के लिए विषाक्त है और संभावित दवा चिकित्सीय को मान्य करने के लिए, हमने मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स14 में फोटोरिसेप्टर विषाक्तता की परख के लिए इस प्रोटोकॉल को विकसित किया है।
यहां हम मानव रेटिना ऑर्गेनोइड्स को अलग करने, ऑर्गेनोइड्स का उपयोग करके विषाक्तता और बचाव परख स्थापित करने और परिणामों को निर्धारित करने के लिए एक विशिष्ट प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करते हैं। हम एक सफल उदाहरण प्रदान करते हैं जहां हम एक संदिग्ध बीमारी पैदा करने वाले एजेंट, डीऑक्सीएसएल की ऊतक-विशिष्ट विषाक्तता का निर्धारण करते हैं, और डीऑक्सीएसएल-प्रेरित रेटिना विषाक्तता के संभावित उपचार के लिए एक सुरक्षित जेनेरिक दवा, फेनोफिब्रेट के उपयोग को मान्य करते हैं। पिछले काम से पता चला है कि फेनोफिब्रेट डीऑक्सीएसएल के क्षरण को बढ़ा सकता है और रोगियों में डीऑक्सीएसएल को कम कर सकता है, हालांकि, डीऑक्सीएसएल-प्रेरित रेटिना विषाक्तता को कम करने में इसकी प्रभावकारिताका परीक्षण नहीं किया गया है। यद्यपि हम एक विशिष्ट उदाहरण प्रस्तुत करते हैं, इस प्रोटोकॉल का उपयोग रेटिना ऊतक पर किसी भी चयापचय / पर्यावरणीय तनाव और संभावित चिकित्सीय दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विभेदन प्रोटोकॉल भिन्नताएं
योशिकी सासाई के समूह20 द्वारा स्व-निर्माण ऑप्टिक कप के आविष्कार के बाद से, कई प्रयोगशालाओं ने रेटिना ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल विकसित किए हैं…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लोवी मेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट द्वारा समर्थित। हम मैकटेल परियोजना के समर्थन के लिए लोवी परिवार को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम पांडुलिपि तैयार करने में उनके बौद्धिक इनपुट और सहायता के लिए मारी गैंटनर, माइक डोरेल और ली शेपके को धन्यवाद देना चाहते हैं।
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
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