제약 발견을 위한 인간 망막 오가노이드의 독성 스크리닝
Summary
여기에서 우리는 성숙한 인간 망막 오가노이드를 생성하고 이를 광수용체 독성 분석에 활용하여 연령 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 제약 후보를 식별하는 단계별 프로토콜을 제시합니다.
Abstract
오가노이드는 세포 배양의 다양성과 처리량을 통해 인간 조직의 맥락에서 직접 질병 메커니즘 및 치료법을 연구할 수 있는 유망한 플랫폼을 제공합니다. 성숙한 인간 망막 오가노이드는 노화 관련 망막 퇴행성 질환 황반 모세혈관확장증 2형(MacTel)에 대한 잠재적인 약물 치료법을 스크리닝하는 데 사용됩니다.
우리는 최근에 MacTel이 비정형 지질 종인 deoxysphingolipids (deoxySLs)의 상승 된 수준으로 인해 발생할 수 있음을 보여주었습니다. 이러한 지질은 망막에 독성이 있으며 MacTel 환자에서 발생하는 광수용체 손실을 유발할 수 있습니다. deoxySL 광수용체 독성을 예방하는 능력에 대해 약물을 스크리닝하기 위해 비-MacTel 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 계통에서 인간 망막 오가노이드를 생성하고 기능적으로 성숙한 광수용체를 포함하여 망막의 모든 신경 계통 유래 세포를 발달시키는 유사분열 후 연령으로 성숙시켰습니다. 망막 오가노이드를 deoxySL 대사산물로 처리하고 면역조직화학을 사용하여 광수용체층 내에서 세포자멸사를 측정했습니다. 이 독성 모델을 사용하여 deoxySL 유도 광수용체 사멸을 방지하는 약리학적 화합물을 스크리닝했습니다. 표적 후보 접근법을 사용하여 고콜레스테롤 및 중성지방 치료를 위해 일반적으로 처방되는 약물인 페노피브레이트가 망막 세포에서 deoxySL 독성을 예방할 수 있음을 확인했습니다.
독성 스크리닝은 광수용체 사멸을 예방할 수 있는 FDA 승인 약물을 성공적으로 식별했습니다. 이것은 테스트된 질병 관련성이 높은 모델로 인해 직접 실행 가능한 결과입니다. 이 플랫폼은 망막 질환의 향후 치료 발견을 위해 여러 대사 스트레스 요인과 잠재적인 약리학적 개입을 테스트하도록 쉽게 수정할 수 있습니다.
Introduction
세포 배양 및 동물 모델에서 인간 질병을 모델링하는 것은 약리학적 치료제의 발견, 변형 및 검증을 위한 귀중한 도구를 제공하여 후보 약물에서 승인된 치료법으로 발전할 수 있도록 합니다. in vitro 및 non-human in vivo 모델의 조합은 오랫동안 약물 개발 파이프라인의 중요한 구성 요소였지만 신약 후보의 임상 성능을 예측하지 못하는 경우가 많습니다1. 단순한 인간 세포 단일 배양과 임상 시험 사이의 격차를 해소하는 기술 개발이 분명히 필요합니다. 자가 조직화된 3차원 조직 배양인 오가노이드의 최근 기술 발전으로 모델링한 조직에 대한 충실도가 향상되어 전임상 약물 개발 파이프라인에서 유망한 도구가 되었습니다2.
비인간 생체 모델에 비해 인간 세포 배양의 주요 이점은 인간 대사의 특정 복잡성을 복제할 수 있다는 것인데, 이는 인간과 생쥐와 같은 고차원 척추동물 사이에서도 상당히 다를 수 있다3. 그러나 이러한 특이성은 조직 복잡성의 손실로 인해 가려질 수 있습니다. 망막 조직의 경우 여러 세포 유형이 복잡하게 얽혀 있고 단일 배양에서 복제할 수 없는 세포 아형 간에 독특한 공생 대사 상호작용이 있습니다4. 세포 배양의 접근성과 확장성을 갖춘 복잡한 인간 조직의 복제물을 제공하는 인간 오가노이드는 이러한 질병 모델링 플랫폼의 결함을 극복할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.
줄기세포에서 유래한 망막 오가노이드는 인간 신경 망막의 복잡한 조직을 모델링하는 데 특히 충실한 것으로 입증되었다5. 이로 인해 망막 오가노이드 모델은 망막 질환의 연구 및 치료를 위한 유망한 기술이 되었습니다 6,7. 지금까지 망막 오가노이드의 질병 모델링의 대부분은 망막 오가노이드가 질병을 유발하는 유전적 변이를 가진 iPSC 계통에서 파생되는 단일 유전자 망막 질환에 초점을 맞추었습니다7. 이들은 일반적으로 발달 표현형으로 나타나는 침투성이 높은 돌연변이입니다. 유전적 돌연변이와 환경적 스트레스 요인이 정상적으로 발달한 조직에 영향을 미치는 노화 질환에 대한 효과적인 연구는 거의 이루어지지 않았습니다. 노화의 신경퇴행성 질환은 복잡한 유전적 유전과 단기 세포 배양을 사용하여 모델링하기 본질적으로 어려운 환경적 스트레스 요인의 기여를 가질 수 있습니다. 그러나 많은 경우 이러한 복잡한 질병이 일반적인 세포 또는 대사 스트레스 요인에 영향을 미칠 수 있으며, 완전히 발달된 인체 조직에서 검사할 경우 노화로 인한 신경퇴행성 질환에 대한 강력한 통찰력을 제공할 수 있다8.
후기 발병 황반 퇴행성 질환인 황반 모세혈관확장증 II형(MacTel)은 일반적인 대사 결함에 합쳐지는 유전적으로 복잡한 신경퇴행성 질환의 좋은 예입니다. MacTel은 황반의 광수용체 및 뮐러 신경교 손실을 초래하여 중심 시력의 점진적인 상실을 초래하는 흔하지 않은 노화의 망막 퇴행성 질환입니다 9,10,11,12,13. MacTel에서 미확인, 아마도 다인성 유전은 환자의 순환 세린의 일반적인 감소를 유도하여 deoxysphingolipids(deoxySL)14,15라고 하는 신경독성 지질 종의 증가를 초래합니다. deoxySL의 축적이 망막에 독성이 있음을 증명하고 잠재적인 제약 치료제를 검증하기 위해, 본 발명자들은 인간 망막 오가노이드의 광수용체 독성을 분석하기 위해 이 프로토콜을 개발했다14.
여기에서는 인간 망막 오가노이드를 구별하고, 오가노이드를 사용하여 독성 및 구조 분석을 설정하고, 결과를 정량화하기 위한 특정 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 우리는 의심되는 질병 유발 물질인 deoxySL의 조직 특이적 독성을 결정하고 deoxySL 유발 망막 독성의 잠재적 치료를 위해 안전한 제네릭 약물인 페노피브레이트의 사용을 검증하는 성공적인 예를 제공합니다. 이전 연구에서는 페노피브레이트가 환자에서 deoxySL의 분해를 증가시키고 순환 deoxySL을 낮출 수 있음을 보여주었지만, deoxySL 유도 망막 독성을 감소시키는 효능은 테스트되지 않았습니다16,17. 구체적인 예를 제시하지만 이 프로토콜은 망막 조직에 대한 여러 대사/환경 스트레스 요인 및 잠재적인 치료 약물의 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
차별화 프로토콜 변형
요시키 사사이(Yoshiki Sasai)의 그룹20에 의한 자가 형성 광학 컵의 발명 이후, 많은 실험실들은 거의 모든 단계 5,18,19,21에서 변할 수 있는 망막 오가노이드를 생성하기 위한 프로토콜을 개발했다. 프로토콜의 전체 목록은 Capowski et al.22…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lowy Medical Research Institute에서 지원합니다. MacTel 프로젝트를 지원해 주신 Lowy 가족에게 감사드립니다. 원고 준비에 도움을 주신 Mari Gantner, Mike Dorrell, Lea Scheppke에게 감사드립니다.
Materials
| 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| 125mL Erlenmeyer Flasks | VWR | 89095-258 | |
| 1-deoxysphinganine | Avanti | 860493 | |
| B27 Supplement, minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Beaver 6900 Mini-Blade | Beaver-Visitec | BEAVER6900 | |
| D-(+)-Sucrose | VWR | 97061-432 | |
| DAPI | Thermo-fisher | D1306 | |
| Dispase II, powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 11995073 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330 | |
| Donkey anti-rabbit Ig-G, Alexa Fluor plus 555 | Thermo-fisher | A32794 | |
| donkey serum | Sigma | D9663-10ML | |
| FBS, Heat Inactivated | Corning | 45001-108 | |
| Fenofibrate | Sigma | F6020 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| Heparin | Stemcell Technologies | 7980 | |
| In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescin | Sigma | 11684795910 | |
| Matrigel, growth factor reduced | Corning | 356230 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Gibco | 11140050 | |
| mTeSR 1 | Stemcell Technologies | 85850 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Pierce 16% Formaldehyde | Thermo-fisher | 28906 | |
| Rabbit anti-Recoverin antibody | Millipore | AB5585 | |
| Sodium Citrate | Sigma | W302600 | |
| Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | MilliporeSigma | SE1M179M6 | |
| Taurine | Sigma | T0625 | |
| Tissue Plus- O.C.T. compound | Fisher Scientific | 23-730-571 | |
| Tissue-Tek Cryomold | EMS | 62534-10 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Ultra-Low Attachment 6 well Plates | Corning | 29443-030 | |
| Ultra-Low Attachment 75cm2 U-Flask | Corning | 3814 | |
| Vacuum Filtration System | VWR | 10040-436 | |
| Vectashield-mounting medium | vector Labs | H-1000 | |
| wax pen-ImmEdge | vector Labs | H-4000 | |
| Y-27632 Dihydrochloride (Rock inhibitor) | Sigma | Y0503 |
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