Isolamento de Hepatócitos Primários de Ratos com Controle de Perfusão Multiparâmetro
Summary
Este protocolo detalha o uso de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura complementado por monitoramento em tempo real e um sistema de alarme para procedimento de perfusão de colagem em duas etapas para melhorar a consistência na viabilidade, rendimento e funcionalidade de hepatócitos primários isolados.
Abstract
Hepatócitos primários são amplamente utilizados em pesquisas básicas sobre doenças hepáticas e para testes de toxicidade in vitro. O procedimento de perfusão de colagem de duas etapas para isolamento primário de hepatócitos é tecnicamente desafiador, especialmente na canulação venosa do portal. O procedimento também é propenso a contaminação ocasional e variações nas condições de perfusão devido a dificuldades na montagem, otimização ou manutenção da configuração de perfusão. Aqui, é apresentado um protocolo detalhado para um procedimento de perfusão de colagem de duas etapas melhorado com controle de perfusão multiparmétrica. Os hepatócitos primários foram isolados com sucesso e confiabilidade, tomando as precauções técnicas necessárias em etapas críticas do procedimento, e reduzindo a dificuldade operacional e mitigando a variabilidade dos parâmetros de perfusão através da adoção de um cateter intravenoso especial, tubos descartáveis estéreis padronizados, controle de temperatura e sistema de monitoramento e alarme em tempo real. Os hepatócitos primários isolados exibem consistentemente alta viabilidade celular (85%-95%), rendimento (2-5 x 108 células por rato de 200-300 g) e funcionalidade (atividade albumina, ureia e CYP). O procedimento foi complementado por um sistema integrado de perfusão, compacto o suficiente para ser configurado na coifa de fluxo laminar para garantir o funcionamento asséptico.
Introduction
Hepatócitos primários são ferramentas importantes para pesquisa básica relacionada ao fígado, tratamento de doenças e aplicação, como testes de drogas. O padrão-ouro atual para o isolamento primário do hepatocito é o procedimento de perfusão de colagem de duas etapas 1,2,3 introduzido pela Seglen na década de 19704. No entanto, este procedimento é tecnicamente desafiador e tem uma alta taxa de falha quando realizado por cirurgiões iniciantes. Mesmo quando uma perfusão é considerada bem sucedida, podem ser observadas diferenças drásticas na viabilidade do hepatocito (tipicamente 60%-95%) e rendimento (0,5-5 x 108 por rato de 200-300 g) entre os isolamentos. Isso influencia a qualidade e a escala dos experimentos a jusante. Além do procedimento técnico, a configuração de perfusão utilizada para o isolamento, seja comercialmente disponível ou personalizada, é um fator contribuinte. Deve-se prestar atenção à montagem, otimização e manutenção da configuração da perfusão. O objetivo deste protocolo é melhorar a taxa de sucesso e a estabilidade entre os isolamentos dos hepatócitos primários de ratos através do controle de perfusão multiparmétrica do procedimento técnico e da configuração de perfusão do procedimento de perfusão de colagenase em duas etapas.
Do ponto de vista técnico, o passo mais difícil no procedimento é a cannulação venosa do portal. Quanto às outras etapas, se forem observadas boas práticas e forem tomadas precauções gerais, a estabilidade do isolamento pode ser melhorada. Portanto, a compreensão do raciocínio de cada passo é importante para que o cirurgião possa responder a diversas variáveis que podem ocorrer durante o procedimento.
Vários protocolos para o isolamento de hepatócitos e células não-parenchímicas hepáticas de ratos e camundongos foram publicados 1,2,5,6,7,8,9. As configurações de perfusão utilizadas nesses protocolos apresentaram diversas desvantagens, que incluem o reaproveitamento da tubulação de perfusão, problemas com controle de temperatura, necessidade de otimização rotineira dos parâmetros de perfusão e/ou uso de tipo inadequado de cateter intravenoso (IV) para cannulação venosa portal. O reaproveitamento da tubulação de perfusão aumentará as chances de contaminação, especialmente se a tubulação não foi limpa e desinfetada corretamente. O reaproveitamento de tubos sem substituição de rotina também exporá a configuração de perfusão a problemas como tubos ou conectores com vazamento, armadilha de bolha entupida e tubulação constrito, que reduzirá substancialmente a pressão e a taxa de fluxo perfusadas, afetando assim a eficiência da digestão hepática. Sem uma fonte de calor constante em algumas configurações para controle de temperatura, os buffers pré-aquecidos esfriarão ao longo do tempo, levando a baixa atividade de colagem e digestão. Embora outras configurações utilizem um condensador de vidro com jaqueta conectado a um circulador de água para aquecer o tampão, eles são volumosos e requerem uma limpeza cuidadosa. A temperatura, pressão e taxa de fluxo de tampão que sai do cateter devem ser medidos e otimizados antes do início do isolamento para garantir a condição estável de perfusão. Mesmo após a otimização, os parâmetros ainda podem mudar na metade durante o isolamento devido às ações do operador, levando assim à perfusão e digestão abaixo do tempo. A maioria dos tipos de cateter IV não são adequados para a cannulação venosa portal porque não permitem perfusão contínua durante a cannulação. Eles são incapazes de informar imediatamente o cirurgião quando a cannulação é bem sucedida. Além disso, é desafiador proteger a veia portal no cateter macio sem deformá-la.
Aqui, abordamos esses problemas usando tubos estéreis descartáveis padronizados, uma jaqueta aquecedora de silicone para controle preciso e estável de temperatura, monitoramento e sistema de alarme em tempo real com armazenamento e gerenciamento de dados e uso de um cateter IV especial, que permite perfusão contínua ao perfurar a veia portal durante a cannulação. Pelo que sabemos, somos o primeiro grupo a combinar todos esses recursos em um sistema integrado de perfusão (IPS) compacto, tornando-o altamente portátil e capaz de ser encaixado em um capô de fluxo laminar para garantir a operação asséptica.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem alguns pontos que são particularmente importantes de se observar para o procedimento de coagem de duas etapas em geral. Em primeiro lugar, deve-se dar um cuidado especial ao resseccionar o fígado. Certifique-se de que o trato gastrointestinal não esteja danificado, pois o vazamento do conteúdo resultará em contaminação bacteriana. Além disso, evite danificar a cápsula do Glisson, que cobre a superfície do fígado durante o procedimento animal. Se a lágrima for grande o suficiente, pode permitir a liber…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado em parte pelo MOE ARC (MOE2017-T2-1-149); NuHS Innovation Seed Grant 2017 (NUHSRO/2017/051/InnovSeed/02); Instituto de Mecanobiologia de Cingapura (R-714-106-004-135); e Instituto de Bioengenharia e Nanotecnologia, Conselho de Pesquisa Biomédica, Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A*STAR) (Projeto Números IAF-PP H18/01/a0/014, IAF-PP H18/01/a0/K14 e MedCaP-LOA-18-02) para Hanry Yu. Ng Chan Way é um pesquisador da Universidade Nacional de Singapura. Gostaríamos de agradecer à Unidade de Microscopia Confocal & Unidade de Citometria de Fluxo da Universidade Nacional de Cingapura por ajuda e aconselhamento na análise da pureza hepatocyte.
Materials
| Material/Equipment | |||
| 1 mL syringe | Nipro | ||
| 27G needle | Nipro | ||
| Black braided silk non-absorbable, non-sterile surgical suture | Look | SP117 | |
| Bochem 18/10 stainless steel forceps, sharp tip contain bent round tip | Bochem | 10333511 | |
| Disposable Perfusion Set | Vasinfuse | BPF-112 | |
| Floating circular 1.5 mL microcentrifuge tube rack | Sigma-Aldrich | R3133 | |
| German Standard Tissue Forceps, Serrated / 1×2 teeth , 14.5cm | Walentech | ||
| Greiner Cellstar aspirating pipette | Merck | GN710183 | |
| Haemocytometer | |||
| Integrated Perfusion System | Vasinfuse | IPS-001 | |
| Iris Scissors curved, stainless, 11cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | CVD | |
| Light microscope with 10X lens | Olympus | ||
| Mesh Sheet 100µM Nylon | Spectra-Teknic(s) Pte Ltd | 06630-75 | |
| Operating Scissors, BL/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – BL/BL | |
| Operating Scissors, SH/BL, 13cm | Optimal Medical Products Pte Ltd | STR – SH/BL | |
| Reverse force hemostatic clip | Shanghai Jin Zhong Pte Ltd | XEC230 | |
| Water bath | Grant | ||
| Reagents/Chemicals | |||
| 10X Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | ||
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9056 | |
| CaCl2·2H2O | Merck | 137101 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | |
| Dexamethasone | TCI | D1961 | |
| DMEM | Gibco | 31600-034 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Invitrogen | 11344-041 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | 1-9278 | |
| KCl | VWR | VWRC26764.298 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | |
| Linoleic acid | Sigma-Aldrich | L9530 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S8875 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Type I bovine collagen | Advanced BioMatrix | 5005-100ml | |
| William’s E Media | Sigma-Aldrich | W1878 |
References
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