Protocoles de PCR numérique en gouttelettes à transcription inverse en deux étapes pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2

Résumé

Ce travail résume les étapes du développement de différents tests pour la détection du SARS-CoV-2 à l’aide d’un système ddPCR bicolore. Les étapes sont élaborées et des notes ont été incluses sur la façon d’améliorer les tests et les performances expérimentales. Ces tests peuvent être utilisés pour plusieurs applications SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Résumé

Le diagnostic de la pandémie actuelle de SRAS-CoV-2 est une priorité pour tous les pays du monde. Actuellement, la PCR quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) est l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2 car aucune solution permanente n’est disponible. Quelle que soit l’efficacité de cette technique, des recherches ont émergé montrant ses limites dans la détection et le diagnostic, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles peu abondantes. En revanche, il a été démontré que la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), une technologie émergente récente présentant des avantages supérieurs à la qPCR, permet de surmonter les défis de la RT-qPCR dans le diagnostic du SRAS-CoV-2 à partir d’échantillons cibles peu abondants. Prospectivement, dans cet article, les capacités de la RT-ddPCR sont encore étendues en montrant les étapes à suivre pour développer des tests simplex, duplex, triplex et quadruplex à l’aide d’un système de détection bicolore. En utilisant des amorces et des sondes ciblant des sites spécifiques du génome du SRAS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 et RBD2), le développement de ces tests s’avère possible. De plus, des protocoles détaillés, des notes et des suggestions étape par étape sur la façon d’améliorer le flux de travail des tests et d’analyser les données sont fournis. L’adaptation de ce flux de travail dans les travaux futurs garantira que le nombre maximal de cibles peut être détecté de manière sensible dans un petit échantillon, ce qui améliorera considérablement le coût et le débit de l’échantillon.

Introduction

La réaction en chaîne de la polymérase (PCR), une technique bien reconnue, a subi plusieurs transformations depuis son avènement pour devenir une technique puissante capable d’apporter des réponses à la recherche sur les acides nucléiques. Ces transformations ont été une amélioration constante de l’ancienne technique. Ces transformations peuvent se résumer en trois générations¹. La première génération est la PCR conventionnelle qui repose sur l’électrophorèse sur gel pour quantifier et détecter les cibles amplifiées. La deuxième génération est la PCR quantitative en temps réel (qPCR) qui peut détecter des échantillons en temps réel et s’appuyer....

Protocole

Déclaration éthique
L’Institut de virologie de Wuhan (WHIOV) fait partie des laboratoires et instituts approuvés par le CDC chinois de la ville de Wuhan pour mener des recherches sur le SRAS-CoV-2 et détecter la COVID-19 à partir d’échantillons cliniques. La recherche sur le développement de nouvelles techniques de diagnostic de la COVID-19 à l’aide d’échantillons cliniques a également été approuvée par le comité d’éthique de l’Institut de virologie de Wuhan (2020FCA001).

1. Flux de travail de traitement des échantillons (Figure 1A)

REMARQUE : Tout au long du protoc....

Résultats

Dans une étude de validation de principe, la performance analytique des tests multiplex a été testée sur des échantillons cliniques et de recherche¹⁹. La performance des tests multiplex était supérieure à celle d’une RT-PCR¹⁹. Étant donné qu’un faible nombre de gouttelettes peut indiquer un problème lors de la génération de gouttelettes, dans cet article, un seuil de 10 000 gouttelettes par puits a été fixé sur la base de données empiriques.

Une .......

Discussion

Peu de ressources sont disponibles sur la façon de développer des tests RT-ddPCR pour la détection du SRAS-CoV-2. Bien qu’ils ne soient pas utilisés dans cet article, des échantillons standard avec des copies connues peuvent être utilisés pour développer et optimiser les essais. Dans ce travail cependant, des échantillons de SARS-CoV-2 cultivés dans des cellules Vero-E6 ont été dopés dans un arrière-plan d’ARN génomique humain et utilisés comme échantillons standard pour développer les tests. Des séquences d’amorce et de.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Extracteur d’acide nucléique entièrement automatique à 32 canaux Purificateur 32	Genfine Biotech	FHT101-32	Extracteur automatisé pour ARN
AutoDG Huile pour sondes	BioRad	12003017	QX200 Consommable AutoDG
ddPCR Plaques à 96 puits	BioRad	12003185
ddPCR Supermix pour sondes (sans dUTP)	BioRad	1863024	Fabrication d’un mastermix de test ddPCR
DG32 AutoDG Cartouches	BioRad	1864108	QX200 Consommable AutoDG
Bain-marie thermostatique électronique	Pékin Changfeng Instrument and Meter Company	XMTD-8000	Inactivation thermique d’échantillons
FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction		FMY502T5	Extraction par billes magnétiques d’échantillons d’ARN inactivés
	Feuille perçable ThermoscellagesBioRad	1814040
Pointes de pipette pour l’AutoDG	BioRad	1864120	QX200 AutoDG
Poubelles pour l’AutoDG	BioRad	1864125	QX200 AutoDG Consommable
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)	TaKaRa	RR036A	génération d’ADNc
PX1 Scelleuse de plaques PCR	BioRad	1814000	Scellez la plaque de gouttelettes de AutoDG
QuantaSoft 1.7 Logiciel	BioRad	10026368	Acquisition et analyse de données
QuantaSoft Analysis Pro 1.0	BioRad	N/A	Analyse de données
QX200 Gererator de gouttelettes automatisé (AutoDG)	BioRad	1864101	QX200 Consommable AutoDG
QX200 Lecteur de gouttelettes	BioRad	1864003	Lecture de gouttelettes et acquisition de données
T100 Thermocycleur	BioRad	1861096	Amplification de la cible des gouttelettes (PCR) et génération d’ADNc