פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2
Summary
עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.
Abstract
אבחון מגיפת SARS-CoV-2 המתמשכת נמצא בראש סדר העדיפויות של כל המדינות ברחבי העולם. נכון לעכשיו, PCR כמותי של שעתוק לאחור (RT-qPCR) הוא תקן הזהב לאבחון SARS-CoV-2 מכיוון שאין פתרון קבוע זמין. יעילה ככל שתהיה טכניקה זו, התגלו מחקרים המראים את מגבלותיה בזיהוי ואבחון, במיוחד כשמדובר במטרות נמוכות בשפע. לעומת זאת, PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), טכנולוגיה מתפתחת לאחרונה עם יתרונות עדיפים על qPCR, הוכחה להתגבר על האתגרים של RT-qPCR באבחון של SARS-CoV-2 מדגימות מטרה בשפע נמוך. באופן פרוספקטיבי, במאמר זה, היכולות של RT-ddPCR מורחבות עוד יותר על ידי הצגת שלבים כיצד לפתח סימפלקס, דופלקס, תערובת בדיקה טריפלקס ומבחני quadruplex באמצעות מערכת זיהוי שני צבעים. באמצעות פריימרים וגשושיות הממוקדים באתרים ספציפיים של גנום SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 ו-RBD2), הפיתוח של בדיקות אלה הוכח כאפשרי. בנוסף, מפורטים צעד אחר צעד פרוטוקולים, הערות והצעות כיצד לשפר את זרימת העבודה של הבדיקות ולנתח נתונים. התאמת זרימת עבודה זו בעבודות עתידיות תבטיח שניתן יהיה לזהות ברגישות את המספר המרבי של יעדים במדגם קטן, שיפור משמעותי בעלות ובתפוקת הדגימה.
Introduction
תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טכניקה מוכרת היטב, עברה מספר טרנספורמציות מאז הופעתה והפכה לטכניקה רבת עוצמה המסוגלת לספק תשובות למחקר חומצות גרעין. טרנספורמציות אלה היו שיפור מתמיד של הטכניקה הישנה. ניתן לסכם תמורות אלה לשלושה דורות1. הדור הראשון הוא PCR קונבנציונלי המסתמך על אלקטרופורזה בג’ל כדי לכמת ולזהות מטרות מוגברות. הדור השני הוא PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) שיכול לזהות דגימות בזמן אמת ולהסתמך על עקומה סטנדרטית כדי לכמת ישירות מטרות בדגימה. הדור השלישי, PCR דיגיטלי (dPCR), יכול לבצע הן זיהוי, והן כימות מוחלט של מטרות חומצות גרעין ללא צורך בעקומה סטנדרטית. dPCR שופר גם עוד יותר מתאי תגובה המופרדים על ידי בארות של קיר לאמולסיות של נפט, מים וכימיקלים מייצבים בתוך אותה באר כפי שניתן לראות ב- PCR דיגיטלימבוסס טיפות 2. ב-Droplet Digital PCR (ddPCR), הדגימה מחולקת לאלפי טיפות בגודל ננוליטר המכילות מטרות בודדות שמאוחר יותר יכומתו באמצעות סטטיסטיקת פואסון 2,3,4. טכניקה זו מעניקה ל- ddPCR יתרון בכימות מטרות נמוכות בשפע בהשוואה לדורות האחרים של PCR.
לאחרונה, יישומים מרובים הדגישו את העליונות של ddPCR על פני qPCR הנפוץ בעת זיהוי וכימות מטרות נמוכות בשפע 1,5,6. SARS-CoV-2 אינו יוצא מן הכלל ליישומים אלה 7,8,9,10,11,12. מאז התפרצות SARS-CoV-2, מדענים עובדים בכל החזיתות כדי למצוא פתרונות כיצד לאבחן את הנגיף ולזהות אותו ביעילות. תקן הזהב הנוכחי עדיין נשאר להיות qPCR13. עם זאת, RT-ddPCR הוכח כמדויק יותר בזיהוי מטרות SARS-CoV-2 בשפע נמוך מדגימות סביבתיות וקליניות בהשוואה ל- RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. רוב העבודות שפורסמו על ידי SARS-CoV-2 ddPCR תלויות במבדקים חד-צדדיים עם המולטיפלקסים בהתאם למבדקים מסחריים. לפיכך, יש לעשות יותר כדי להסביר כיצד לפתח בדיקות RT-dPCR מרובות לזיהוי SARS-CoV-2.
בתכנון בדיקה נכון, ניתן להשתמש בריבוב כדי לחסוך בעלויות, להגדיל את תפוקת הדגימה ולמקסם את מספר המטרות שניתן לזהות ברגישות בתוך מדגם קטן. כאשר ריבוב עם ddPCR, יש לקחת בחשבון כמה fluorophores ניתן לזהות במערכת מסוימת. פלטפורמות ddPCR מסוימות יכולות לתמוך בעד שלושה ערוצים בעוד שאחרות תומכות בשני ערוצים בלבד. לפיכך, בעת ריבוב עם שני ערוצים, יש להשתמש בגישות שונות, כולל ריבוב מסדר גבוה יותר כדי לזהות יותר משתי מטרות14,15,16. בעבודה זו, מערכת זיהוי ddPCR בשני צבעים משמשת כדי להראות שלבים כיצד לפתח מבחני SARS-CoV-2 RT-ddPCR שונים שניתן להתאים ליישומי מחקר שונים.
Protocol
Representative Results
Discussion
מעט משאבים זמינים כיצד לפתח מבחני RT-ddPCR לזיהוי SARS-CoV-2. למרות שלא נעשה שימוש במאמר זה, ניתן להשתמש בדוגמאות סטנדרטיות עם עותקים ידועים כדי לפתח ולמטב מבחנים. עם זאת, בעבודה זו, דגימות SARS-CoV-2 שגדלו בתאי Vero-E6 הוקפצו על רקע של RNA גנומי אנושי ושימשו כדגימות סטנדרטיות לפיתוח הבדיקות. רצפי פריימר ובד?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן על ידי Megaproject of Infectious Disease Control ממשרד הבריאות של סין, מענק מספר 2017ZX10302301-005 ומרכז המחקר המשותף סין-אפריקה, מענק מספר SAJC201605.
Materials
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
- Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world. Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).
- Baker, M. Digital PCR hits its stride. Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).
- Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. dPCR: a technology review. Sensors. 18 (4), 1271 (2018).
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).
- Kuypers, J., Jerome, K. R. Applications of digital PCR for clinical microbiology. Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).
- Li, H., et al. Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases. Bioscience Reports. 38 (6), (2018).
- Liu, X., et al. Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).
- Suo, T., et al. ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens. Emerging Microbes & Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).
- Liu, Y., et al. Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals. Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).
- Lv, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR. Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).
- Yu, F., et al. Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients. Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).
- Scutari, R., et al. Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis. Life. 10 (11), 302 (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection. Preprints. , (2020).
- Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. Fundamentals of multiplexing with digital PCR. Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).
- Dobnik, D., Štebih, D., Blejec, A., Morisset, D., Žel, J. Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection. Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).
- Nyaruaba, R., et al. Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis. Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).
- Lu, R., et al. SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge. medRxiv. , (2020).
- Nyaruaba, R., et al. Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing. Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).
