Her leveres en protokol til time-lapse-billeddannelse af okulær morfogenese ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt lysarkmikroskop og en billedbehandlingsarbejdsstation til analyse af de resulterende data. Denne protokol beskriver procedurerne for embryobedøvelse, indlejring i agarose med lav smeltetemperatur, suspension i billeddannelseskammeret, opsætning af billeddannelsesparametrene og endelig analyse af billeddata ved hjælp af billedanalysesoftware.
Hvirveldyrs øjenudvikling er en kompleks proces, der begynder nær slutningen af embryogastrulation og kræver præcis koordinering af cellemigration, proliferation og differentiering. Time-lapse-forestilling giver unik indsigt i cellernes adfærd under øjenudvikling, fordi det giver os mulighed for at visualisere oculogenese in vivo. Zebrafisk er en fremragende model til at visualisere denne proces på grund af deres stærkt bevarede hvirveldyrs øje og deres evne til at udvikle sig hurtigt og eksternt, mens de forbliver optisk gennemsigtige. Time-lapse billeddannelsesundersøgelser af zebrafisk øjenudvikling lettes i høj grad ved brug af den transgene zebrafiskelinje Tg (rx3: GFP). I den udviklende forhjerne markerer rx3: GFP-ekspression cellerne i det enkelte øjenfelt, og GFP udtrykkes fortsat, når øjenfeltet evaginates for at danne en optisk vesikel, som derefter invaginaterer for at danne en optisk kop. Høj opløsning tidsforløb billeddannelse af rx3: GFP udtryk, giver os derfor mulighed for at spore øjet primordium gennem tiden, da det udvikler sig til nethinden. Lightsheet mikroskopi er en ideel metode til at afbilde okulær morfogenese over tid på grund af dets evne til at trænge ind i tykkere prøver til fluorescerende billeddannelse, minimere fotobleaching og fototoksicitet og billede med høj hastighed. Her leveres en protokol til time-lapse-billeddannelse af okulær morfogenese ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt lysarkmikroskop og en billedbehandlingsarbejdsstation til analyse af de resulterende data. Denne protokol beskriver procedurerne for embryobedøvelse, indlejring i agarose med lav smeltetemperatur, suspension i billeddannelseskammeret, opsætning af billeddannelsesparametrene og endelig analyse af billeddata ved hjælp af billedanalysesoftware. Det resulterende datasæt kan give værdifuld indsigt i processen med okulær morfogenese samt forstyrrelser i denne proces som følge af genetisk mutation, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle manipulationer.
Embryonal udvikling er en kompleks proces, der kræver præcis koordinering af mange forskellige begivenheder. Dannelsen af hvirveldyrøjet begynder i den udviklende forhjerne, hvor en del af cellerne er specificeret som øjenfeltet. Disse celler vil evaginatere mod overfladen ektoderm, hvilket giver anledning til to bilaterale optiske vesikler 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kontakt med overfladeektoderm inducerer derefter en invagination af den optiske vesikel i en optisk kop. Overfladeektodermen vil give anledning til øjets forreste strukturer, såsom linsen og hornhinden, mens den optiske kop vil give anledning til den neurale nethinde og retinal pigmenteret epitel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Forstyrrelser i denne proces kan føre til medfødte defekter såsom mikroftalmi, anophthalmia og coloboma (MAC). På nuværende tidspunkt er der ingen muligheder for at rette op på disse fejl 3,5,6,7,9,10,11,12. Yderligere undersøgelser af mekanismerne for okulær morfogenese og de problemer, der kan føre til MAC, vil give et fundament af viden, der potentielt vil føre til behandlinger. Et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellernes dynamiske adfærd under øjenudvikling er time-lapse-fantasi, som gør det muligt at visualisere og karakterisere denne proces in vivo og i realtid.
Zebrafisk (Danio rerio) er en fremragende model til at visualisere tidlig okulær udvikling ved hjælp af time-lapse-billeddannelse. De har et stærkt bevaret hvirveldyrøje og besidder evnen til at udvikle sig hurtigt og eksternt, mens de forbliver optisk gennemsigtige1. Zebrafisk giver en stor ressource til time-lapse-billeddannelse på grund af disse egenskaber, som pattedyrsmodeller mangler. Time-lapse-billeddannelsesundersøgelser af zebrafiskens øjenudvikling lettes i høj grad ved hjælp af den transgene zebrafiskelinje Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) er en transkriptionsfaktor, der er afgørende for øjenudvikling14. Rx3 er det første af de tre rx-gener i zebrafisken, der udtrykkes, startende med ekspressionen midt i gastrulationen, ca. 8 timer efter befrugtning (hpf)15,16. rx3: GFP-transgenet kan visualiseres i den udviklende forhjerne, der starter ved 1 somitstadiet (ss), ca. 10 hkf 15,17,18,19,20. I den udviklende forhjerne markerer rx3: GFP-ekspression cellerne i det enkelte øjenfelt, og GFP (grønt fluorescerende protein) udtrykkes fortsat gennem resten af okulær morfogenese. Høj opløsning tidsforløb billeddannelse af rx3: GFP udtryk giver os derfor mulighed for at spore det enkelte øjenfelt gennem tiden, da det udvikler sig til nethinden 17,18,20.
Time-lapse billeddannelsesundersøgelser af zebrafiskens udvikling er primært blevet udført ved hjælp af konfokal eller Lightsheet mikroskopi. Konfokal mikroskopi er fordelagtig, fordi den giver mulighed for præcis billeddannelse af prøver langs z-aksen og reducerer fluorescerende baggrundssignal. Det er dog begrænset af den tid, det tager at erhverve et billede, prøvepositionsstivhed og dets tilbøjelighed til fotoblevask og fototoksicitet af levende prøver. Lightsheet mikroskopi er en ideel metode til at afbilde okulær morfogenese over tid på grund af dets evne til at trænge ind i tykkere prøver til fluorescerende billeddannelse, øget fleksibilitet i prøveorientering, minimeret fotobleaching og fototoksicitet og billeddannelse med høj hastighed 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Den rumlige opløsning, der kan opnås med de nuværende lysarkmikrokopisystemer, er ca. 250-500 nanometer (nm). Selvom dette ikke er væsentligt forskelligt fra, hvad der kan opnås med konfokal mikroskopi, kan prøven frit roteres og afbildes fra flere vinkler, hvilket forbedrer både billeddybden og opløsningen og giver meget større fleksibilitet til in vivo time lapse-billeddannelseseksperimenter end den konfokale platform27,32 . Af disse grunde er Lightsheet-mikroskopi hurtigt ved at blive den foretrukne metode til time-lapse-billeddannelsesundersøgelser af zebrafiskens udvikling. Denne protokol beskriver trinnene til kvantificering af oculogenese gennem billeddannelse af Rx3: GFP transgen zebrafisk ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt Lightsheet-mikroskop33 og beskriver en pipeline til billedanalyse ved hjælp af arivis-softwareplatformen.
I denne protokol blev Lightsheet-mikroskopet brugt til at udføre time-lapse-billeddannelse af øjenudvikling, og de resulterende data blev analyseret. Det resulterende datasæt kan give værdifuld indsigt i processen med okulær morfogenese samt forstyrrelser i denne proces som følge af genetisk mutation, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle parametre. Her demonstrerede protokollen, hvordan dette datasæt kan opnås og gav et eksempel på, hvordan man analyserer øjenfeltets volumen gennem tidlig udvikling. Disse data viste sig at være reproducerbare og konsistente (mindre end 10% variation i volumen) på tværs af biologiske replikater, idet man husker på, at små forskelle i embryoiscenesættelse inden starten af løbet kan føre til en vis variation i endelige volumenmålinger.
Der skal tages hensyn til den indledende positionering af embryoet i kapillæren og ved placering af det indlejrede embryo foran målet. Orientering spiller en vigtig rolle i at forhindre embryoet i at vokse og bevæge sig ud af målets syn. Embryonerne har en rund form ved 10 hkf, hvilket gør det udfordrende at garantere en bestemt orientering i kapillæren. Ideelt set vil embryoets krop blive placeret sideværts i kapillæren. Indlæsning af flere embryoner i kapillæren vil øge sandsynligheden for at have et velpositioneret embryo.
I denne procedure er embryoet indlejret i agarose for at suspendere det foran billeddannelses- og belysningsmålene. At vælge den korrekte koncentration af agarose med lav smeltetemperatur er kritisk. For høj koncentration vil indsnævre embryoet og forhindre det i at udvikle sig korrekt; for lav koncentration vil resultere i, at agarose falder fra hinanden og ikke holder embryoet. Den koncentration, der er optimal for denne protokol, er en endelig koncentration på 1% lav smeltetemperatur agarose30,31.
Et andet element, der skal tages i betragtning, er mætningsniveauet. Efterhånden som øjenfeltet vokser og differentieres, intensiveres styrken af Rx3: GFP-signalet. Derfor, når du indstiller de indledende billeddannelsesparametre, skal eksponeringen og lasereffekten reduceres for at undermætte billedet. Dette forhindrer billedet i at blive overmættet, da Rx3: GFP bliver lysere over tid. Der kan foretages ændringer for at korrigere for undermætning i billedbehandling, men overmætning kan ikke korrigeres, efter at billederne er erhvervet.
Der er et par yderligere ændringer, der kan foretages i denne protokol, som kan være fordelagtige for nogle projekter, der ikke er beskrevet i dette papir. Det er f.eks. muligt at konfigurere Multiview-billeddannelse i opsætningen af billedoptagelse. Denne parameter ville gøre det muligt at afbilde flere embryoner på forskellige positioner langs y-aksen sekventielt ved hvert tidsinterval. Samtidig med at det tilføjer kompleksitet til datasættet, vil det øge dataindsamlingshastigheden. Derudover er det med hensyn til billedbehandling muligt at kvantificere øjenfeltet ved hjælp af andre parametre. Her beskrev vi, hvordan man kvantificerer dataene med hensyn til øjenfeltvolumen. Alternativt kan der laves en rørledning til at kvantificere og spore individuelle celler eller bestemme hastigheden af optisk vesikleforherligelse.
Som tidligere nævnt er både konfokal og Lightsheet mikroskopi blevet brugt til at udføre time-lapse billeddannelsesundersøgelser af zebrafisk. Lightsheet blev specielt udvalgt til dette projekt på grund af dets overlegne evne til at afbilde gennem en tyk (>1 mm) prøve, fordi det er udstyret med en inkubationsenhed for at opretholde et ideelt temperaturmiljø for zebrafiskembryoet, og fordi dets evne til at afbilde hurtigere end konfokal mikroskopi muliggør billedoptagelse med de mange tidsintervaller, der kræves til denne protokol, ingen ledsagende skade eller fotoblegning af embryoet21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det er også vigtigt at bemærke, at Lightsheet-mikroskopet er udstyret til at afbilde signalet fra flere fluoroforer. Lightsheet-mikroskopet, der anvendes i denne undersøgelse, har solid state laser excitationslinjer ved 405, 445, 488, 515, 561 og 638 nm, hvilket kan være nyttigt til billeddannelse af transgene embryoner, der udtrykker mere end et fluorescerende reportertransgen.
Mens denne protokol beskriver instruktioner til billedoptagelsesanalyse specifikt ved hjælp af Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System og arivis Vision4D-analysesoftware, er der andre kommercielt tilgængelige Lightsheet-mikroskoper fremstillet af Leica, Olympus og Luxendo samt billedanalysesoftware fra Imaris, der kan bruges til at opnå lignende resultater. Udvælgelsen af udstyr og software til denne protokol blev bestemt af tilgængeligheden på vores institution.
Sammenfattende forventes det, at denne protokol vil give et solidt udgangspunkt for at udføre time-lapse-billeddannelse ved hjælp af Lightsheet-mikroskopi og for billedkvantificering af tidlig øjenudvikling hos zebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapporteret i denne publikation blev støttet af Office of The Director of the National Institutes of Health (NIH) under Award Number S10OD020067 og af NIH award R01EY021769 (til A.C.M.). Vi er taknemmelige for hjælpen fra Doug Harrison og Jim Begley i Arts & Sciences Imaging Center ved University of Kentucky og til Lucas Vieira Francisco og Evelyn M. Turnbaugh for ekspert zebrafisk pleje.
60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |