Her er det gitt en protokoll for tidsforløpavbildning av okulær morfogenese ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig lysarkmikroskop og en bildebehandlingsarbeidsstasjon for å analysere de resulterende dataene. Denne protokollen beskriver prosedyrene for embryobedøvelse, innebygging i lav smeltetemperatur, suspensjon i bildekammeret, oppsett av bildeparametere og til slutt analyse av bildedata ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
Virveldyr øyeutvikling er en kompleks prosess som begynner nær slutten av embryo gastrulation og krever presis koordinering av cellemigrasjon, spredning og differensiering. Tidsforløp imagining gir unik innsikt i oppførselen til celler under øyeutvikling fordi det lar oss visualisere oculogenese in vivo. Sebrafisk er en utmerket modell for å visualisere denne prosessen på grunn av deres høyt bevarte virveldyrøye og deres evne til å utvikle seg raskt og eksternt mens de forblir optisk gjennomsiktige. Tidsforløpsavbildningsstudier av sebrafisk øyeutvikling er sterkt tilrettelagt ved bruk av den transgene sebrafisklinjen Tg (rx3:GFP). I utviklingen av forebrain markerer rx3:GFP-uttrykket cellene i det ene øyefeltet, og GFP fortsetter å bli uttrykt når øyefeltet evaginerer for å danne en optisk vesicle, som deretter invaginerer for å danne en optisk kopp. Høyoppløselig tidsforløp bildebehandling av rx3: GFP uttrykk, derfor tillater oss å spore øyet primordium gjennom tiden som det utvikler seg til netthinnen. Lightsheet-mikroskopi er en ideell metode for å avbilde okulær morfogenese over tid på grunn av sin evne til å trenge inn i tykkere prøver for fluorescerende avbildning, minimere fotobleaching og fototoksisitet og bilde med høy hastighet. Her er det gitt en protokoll for tidsforløpavbildning av okulær morfogenese ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig lysarkmikroskop og en bildebehandlingsarbeidsstasjon for å analysere de resulterende dataene. Denne protokollen beskriver prosedyrene for embryobedøvelse, innebygging i lav smeltetemperatur, suspensjon i bildekammeret, oppsett av bildeparametere og til slutt analyse av bildedata ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Det resulterende datasettet kan gi verdifull innsikt i prosessen med okulær morfogenese, samt perturbasjoner til denne prosessen som følge av genetisk mutasjon, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle manipulasjoner.
Embryonisk utvikling er en kompleks prosess som krever presis koordinering av mange forskjellige hendelser. Dannelsen av virveldyrøyet begynner i utviklingen av forebrain, hvor en del av cellene er spesifisert som øyefeltet. Disse cellene vil unngå mot overflaten ektoderm, noe som gir opphav til to bilaterale optiske vesikler 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Kontakt med overflaten ectoderm induserer deretter en invaginering av den optiske vesicle i en optisk kopp. Overflaten ektoderm vil gi opphav til fremre strukturer i øyet, som linsen og hornhinnen, mens den optiske koppen vil gi opphav til nevral netthinne og netthinnen pigmentert epitel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 . Forstyrrelser i denne prosessen kan føre til medfødte feil som mikroftalami, anophthalmia og coloboma (MAC). På dette tidspunktet er det ingen alternativer for å rette opp disse feilene 3,5,6,7,9,10,11,12. Videre studier av mekanismene for okulær morfogenese og problemene som kan føre til MAC vil gi et grunnlag av kunnskap som potensielt vil føre til behandlinger. Et kraftig verktøy for å undersøke cellenes dynamiske oppførsel under øyeutvikling er tidsforløp imagining, noe som gjør at denne prosessen kan visualiseres og karakteriseres i vivo og i sanntid.
Sebrafisk (Danio rerio) er en utmerket modell for å visualisere tidlig okulær utvikling ved hjelp av tidsforløpavbildning. De har et svært konservert virveldyrøye og har evnen til å utvikle seg raskt og eksternt mens de forblir optisk gjennomsiktig1. Sebrafisk gir en flott ressurs for tidsforløpavbildning på grunn av disse egenskapene som pattedyrmodeller mangler. Tidsforløpavbildningsstudier av sebrafisk øyeutvikling er sterkt tilrettelagt ved bruk av den transgene sebrafisklinjen Tg(rx3:GFP)13. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) er en transkripsjonsfaktor som er avgjørende for øyeutvikling14. Rx3 er den første av de tre rx genene i sebrafisken som skal uttrykkes, og starter sitt uttrykk midt i gastrulation, ca 8 h post befruktning (hpf)15,16. Rx3:GFP-transgene kan visualiseres i den utviklende forebrain fra og med 1 somite stadium (ss), ca 10 hpf 15,17,18,19,20. I utviklingen av forebrain markerer rx3:GFP-uttrykket cellene i det ene øyefeltet, og GFP (grønt fluorescerende protein) fortsetter å uttrykkes gjennom resten av okulær morfogenese. Høyoppløselig tidsforløp bildebehandling av rx3: GFP uttrykk, derfor tillater oss å spore enkelt øye feltet gjennom tiden som det utvikler seg til netthinnen 17,18,20.
Tidsforløpsavbildningsstudier av sebrafiskutvikling har primært blitt utført ved hjelp av konfekt- eller Lightsheet-mikroskopi. Konfektmikroskopi er fordelaktig ved at den muliggjør presis avbildning av prøver langs z-aksen og reduserer fluorescerende bakgrunnssignal. Det er imidlertid begrenset av hvor lang tid det tar å skaffe seg et bilde, prøveposisjonsstivhet og dets tilbøyelighet til fotobleaching og fototoksisitet av levende prøver. Lightsheet-mikroskopi er en ideell metode for å avbilde okulær morfogenese over tid på grunn av dens evne til å trenge inn i tykkere prøver for fluorescerende avbildning, økt fleksibilitet i prøveretningen, minimert fotobleaching og fototoksisitet, og bildebehandling med høy hastighet 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Den romlige oppløsningen som kan oppnås med dagens lysarkmikrokopisystemer er ca. 250-500 nanometer (nm). Selv om dette ikke er vesentlig forskjellig fra det som kan oppnås med konfektmikroskopi, kan prøven fritt roteres og avbildes fra flere vinkler, forbedre både bildedybde og oppløsning, og gi mye større fleksibilitet for in vivo tidsforløp bildebehandling eksperimenter enn den konfiskere plattformen27,32 . Av disse grunnene blir Lightsheet-mikroskopi raskt den foretrukne metoden for tidsforløpavbildningsstudier av sebrafiskutvikling. Denne protokollen beskriver trinnene for kvantifisering av oculogenese gjennom avbildning av Rx3:GFP transgen sebrafisk ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig Lightsheet-mikroskop33 og beskriver en rørledning for bildeanalyse ved hjelp av arivis-programvareplattformen.
I denne protokollen ble Lightsheet-mikroskopet brukt til å utføre tidsforløpavbildning av øyeutvikling og de resulterende dataene ble analysert. Det resulterende datasettet kan gi verdifull innsikt i prosessen med okulær morfogenese, samt perturbasjoner til denne prosessen som følge av genetisk mutasjon, eksponering for farmakologiske midler eller andre eksperimentelle parametere. Her demonstrerte protokollen hvordan dette datasettet kan oppnås og ga et eksempel på hvordan man analyserer volumet av øyefeltet gjennom tidlig utvikling. Disse dataene ble funnet å være reproduserbare og konsistente (mindre enn 10% variasjon i volum) på tvers av biologiske replikeringer, med tanke på at små forskjeller i embryooppsamling før starten av løpet kan føre til en viss variasjon i endelige volummålinger.
Det bør tas hensyn til den første plasseringen av embryoet i kapillæren og i plassering av det innebygde embryoet foran målet. Orientering spiller en viktig rolle i å forhindre at embryoet vokser og beveger seg ut av målets syn. Embryoene har en rund form på 10 hkf, noe som gjør det utfordrende å garantere en bestemt orientering i kapillæren. Ideelt sett vil embryoets kropp bli plassert lateralt i kapillæren. Lasting av flere embryoer i kapillæren vil øke sannsynligheten for å ha et godt posisjonert embryo.
I denne prosedyren er embryoet innebygd i agarose for å suspendere det foran avbildnings- og belysningsmålene. Å velge riktig konsentrasjon av den lave smeltetemperaturen er kritisk. For høy konsentrasjon vil begrense embryoet og forhindre at det utvikler seg riktig; for lav konsentrasjon vil føre til at agarose faller fra hverandre og ikke holder embryoet. Konsentrasjonen optimal for denne protokollen er en endelig konsentrasjon på 1% lav smeltetemperatur agarose30,31.
Et annet element som bør tas i betraktning er metningsnivået. Etter hvert som øyefeltet vokser og skiller seg ut, intensiveres styrken til Rx3:GFP-signalet. Når du angir de første bildeparameterne, bør derfor eksponeringen og lasereffekten reduseres for å undermette bildet. Dette forhindrer at bildet blir overmettet etter hvert som Rx3:GFP blir lysere over tid. Endringer kan gjøres for å korrigere for undermetning i bildebehandling, men overmetning kan ikke korrigeres etter at bildene er anskaffet.
Det er noen flere endringer som kan gjøres i denne protokollen som kan være fordelaktige for noen prosjekter som ikke er beskrevet i dette dokumentet. Det er for eksempel mulig å definere Multiview-avbildning i bildeanskaffelsesoppsettet. Denne parameteren vil tillate at flere embryoer i forskjellige posisjoner langs y-aksen blir sekvensielt avbildet ved hvert tidsintervall. Når du legger til kompleksitet i datasettet, vil det øke frekvensen av datainnsamling. I tillegg, når det gjelder bildebehandling, er det mulig å kvantifisere øyefeltet med andre parametere. Her beskrev vi hvordan du kvantifiserer dataene når det gjelder øyefeltvolumet. Alternativt kan en rørledning gjøres for å kvantifisere og spore individuelle celler eller bestemme frekvensen av optisk vesicle evaginering.
Som tidligere nevnt har både konfekt- og Lightsheet-mikroskopi blitt brukt til å utføre tidsforløpsavbildningsstudier av sebrafisk. Lightsheet ble spesielt valgt for dette prosjektet på grunn av sin overlegne evne til å bilde gjennom en tykk (>1 mm) prøve, fordi den er utstyrt med en inkubasjonsenhet for å opprettholde et ideelt temperaturmiljø for sebrafiskembryoet, og fordi dens evne til å bildese med en raskere hastighet enn konfokal mikroskopi tillater bildeanskaffelse ved de mange tidsintervallene som kreves for denne protokollen, ingen tilhørende skade eller fotobleaching avembryoet 21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Det er også viktig å merke seg at Lightsheet-mikroskopet er utstyrt for å avbilde signalet fra flere fluoroforer. Lightsheet-mikroskopet som brukes i denne studien har solid state laser eksitasjonslinjer ved 405, 445, 488, 515, 561 og 638 nm, noe som kan være nyttig for avbildning av transgene embryoer som uttrykker mer enn en fluorescerende reportertransgene.
Mens denne protokollen beskriver instruksjoner for bildeanskaffelsesanalyse spesielt ved hjelp av Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System og arivis Vision4D analyseprogramvare, er det andre kommersielt tilgjengelige Lightsheet-mikroskoper laget av Leica, Olympus og Luxendo, samt bildeanalyseprogramvare av Imaris, som kan brukes til å oppnå lignende resultater. Valg av utstyr og programvare for denne protokollen ble bestemt av tilgjengeligheten ved vår institusjon.
Oppsummert forventes det at denne protokollen vil gi et solid utgangspunkt for å utføre tidsforløpavbildning ved hjelp av Lightsheet-mikroskopi, og for bilde kvantifisering av tidlig øyeutvikling i sebrafisk.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av Office of The Director of the National Institutes of Health (NIH) under Prisnummer S10OD020067 og av NIH-prisen R01EY021769 (til A.C.M.). Vi er takknemlige for hjelpen fra Doug Harrison og Jim Begley i Arts &Sciences Imaging Center ved University of Kentucky, og til Lucas Vieira Francisco og Evelyn M. Turnbaugh for ekspert sebrafiskpleie.
60mL Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309653 |
Agarose, Low Melting Temperature | Promega | V2111 |
arivis Vision4D Software | arivis | https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d |
Dumoxel N3C Forceps | Dumont | 0203-N3C-PO |
E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4) | ||
Glass Capillary – Size 2 (~1mm) | Zeiss | Black/701904 |
Heidelberger Extension Line 100cm | B. Braun | 4097262 |
Light & Filter Set – Royal Blue | Night Sea | SFA-LFS-RB |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-302 |
Stereomicroscope Fluorescence Adapter | NightSea | |
Teflon Tipped Plunger – Size 2 | Zeiss | #701997 |
Tg(rx3:GFP) zebrafish | This line was established by Rembold et al.13 | |
Tricaine (MS222) | Sigma | A-5040 |
Z.1 Lightsheet | Zeiss | |
Zen Software | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html |