כאן, אנו מציגים שיטה לחקירת מורפוגנזה נויריט ברשתית לאחר הלידה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לשגות זמן. אנו מתארים גישה לתיוג דליל ורכישה של סוגי תאי רשתית ותהליכים עדינים שלהם באמצעות וקטורים וירוס הקשורים אדנו רקומביננטי המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre.
גילוי מנגנונים שמעצבים ארבורים דנדריטיים דורש שיטות להמחשה, דימוי וניתוח דנדריטים במהלך הפיתוח. רשתית העכבר היא מערכת מודל רבת עוצמה לחקירה של מנגנונים ספציפיים לסוג התא של מורפוגנזה עצבית וקישוריות. הארגון וההרכב של תת-סוגים ברשתית מוגדרים היטב, וכלים גנטיים זמינים כדי לגשת לסוגים ספציפיים במהלך הפיתוח. סוגי תאי רשתית רבים מגבילים גם את הדנדריטים ו/או האקסונים שלהם לשכבות צרות, מה שמאפשר הדמיה בזמן לשגות. תרביות רשתית העכבר מתאימות היטב להדמיית תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מולטיפוטונית, אך חסרות שיטות המותאמות לדינמיקת דנדריט הדמיה עם רזולוציה זמנית ומבנית. מוצג כאן היא שיטה לתייג ולדמיין בדלילות את ההתפתחות של אוכלוסיות רשתית ספציפיות המסומנות על ידי מערכת Cre-Lox. וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) הזמינים מסחרית המשמשים כאן מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה באופן תלוי Cre- תלוי. משלוח תוך עיני של AAVs בעכברים יילודים מייצר תיוג פלואורסצנטי של סוגי תאים ממוקדים על ידי 4-5 ימים לאחר ההזרקה (dpi). אותות פלואורסצנטיים ממברנה ניתנים לזיהוי על ידי הדמיה קונפוקלית ולפתור מבני ענף עדינים ודינמיקה. קטעי וידאו באיכות גבוהה המשתרעים על פני 2-4 שעות נרכשים מהדמיית רשתית שטוחה-תושבות עם נוזל שדרתי מלאכותי מחומצן (aCSF). כמו כן מסופק צינור לאחר עיבוד תמונה עבור deconvolution ותיקון סחיפה תלת מימדי (3D). פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה ולזהות גורמים חדשניים השולטים מורפוגנזה neurite. אסטרטגיות התפתחותיות רבות הנלמדות ברשתית יהיו רלוונטיות להבנת היווצרות מעגלים עצביים במקומות אחרים במערכת העצבים המרכזית.
דנדריטים של נוירונים ברשתית יוצרים דפוסים מורכבים, אך ספציפיים, המשפיעים על תפקידם בתוך מעגלים עצביים. ברשתית החולייתנית, סוגים מגוונים של תאי גנגליון רשתית (RGCs) ואינטראורונים תא amacrine נושאים מורפולוגיות דנדריטיות ייחודיות השונות בגודל ארבור, מיקום, אורך ענף, וצפיפות1. במהלך התפתחות לאחר הלידה, RGCs ותאי amacrine להרחיב תהליכים דנדריטיים תוססים לתוך נוירופיל הנקרא שכבת plexiform הפנימית (IPL), שם הם מקבלים קלט תא דו קוטבי המשדר אותות photoreceptor2. כפי שנתפס על ידי הדמיה בזמן-לשגות של אוכלוסיות רשתית שכותרתו פלואורסצנטית בזחלי אפרוחים או דגי זברה, מורפוגנזה דנדריט הוא דינמי מאוד 3,4,5. בתוך ימים, arbors דנדריטי להרחיב, לשפץ, ו ramify כדי לצמצם את שכבות המשנה של IPL, שם הם סינפסה עם שותפים נבחרים. הארבורים מציגים דינמיקה מבנית שונה על פני ההתפתחות, עם שינויים בשיעורים היחסיים של תוספת ענף, נסיגה וייצוב. אמקרין ודנדריטים של RGC מפגינים גם התנהגויות שונות של צמיחה ושיפוץ שעשויות לשקף ארבוריזציה ספציפית לסוג. עם זאת, מחקרים אלה עקבו אחר אוכלוסיות אמקרין או RGC רחבות והתמקדו במיקוד למינארי, שהוא רק היבט אחד של המורפולוגיה.
המנגנונים המייצרים את המגוון המורפולוגי העצום שנצפו על פני תת-סוגים ברשתית אינם מובנים כהלכה. מטרתה של קבוצה זו הייתה לפתח שיטה ללכידת דינמיקה דנדריקית ושיפוץ ארבור של תת-סוגים מוגדרים של רשתית בעכברים. זיהוי מנגנונים ספציפיים לסוג התא של דפוסי דנדריט דורש שיטות כדי לדמיין ולמדוד התנהגויות דנדריט של תאים מעניינים. תרביות אורגנוטיפיות של רשתיות עכבר מתאימות היטב למחקרי הדמיה של תאים חיים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או רב-פוטונית. הרשתיות המתפתחות מנותחות ומורכבות לתוך גולה שטוח שניתן לצלם במשך מספר שעות בחדר הקלטות או לתרבות במשך כמה ימים עם השפעות מוגבלות על המעגלים 6,7. נוירוני רשתית חיים יכולים להיות מסומנים על ידי מגוון טכניקות, כולל מילוי צבע על ידי אלקטרודות, אלקטרופורציה, משלוח ביוליסטי של חלקיקים מצופים בצבעים ליפופיליים או פלסמידים קידוד חלבונים פלואורסצנטיים (למשל, Gene Gun), כמו גם תוויות תאים מקודדים גנטית7,8,9,10 . עם זאת, גישות אלה אינן יעילות עבור הדמיה דנדריט דינמיקה של תת סוגים ספציפיים ברשתית. לדוגמה, שיטות מילוי צבע הן בעלות תפוקה נמוכה ודורשות מנגנון אלקטרופיזיולוגי ותוויות גנטיות נוספות לתאי יעד אמינים של עניין. יתר על כן, אותות הפלואורסצנטיות החזקים בסומא יכולים לטשטש דנדריטים סמוכים.
שיטות העברת גנים ביוליסטיות יכולות לתייג בו זמנית עשרות תאים, אך צעדים הכוללים אספקת חלקיקים בלחץ גבוה ודגרה לילית של רשתית מבודדת עלולים לסכן את הפיזיולוגיה של התא ואת הצמיחה הדנדריטית. מאמר זה מציע כי כלים גנטיים אחרונים ניתן להשתמש כדי ללכוד דינמיקה דנדריט מוקדם עם סוג התא ורזולוציה מבנית, בהתחשב בקריטריונים הניסיוניים הבאים. ראשית, כדי לפתור את הענפים העדינים ואת הפילופודיה השולטים arbors המתפתחים, השיטה צריכה לתייג נוירונים עם חלבונים בהירים, פלואורסצנטיים הממלאים תהליכים בכל הארבור. תיוג הפלואורסצנטיות לא אמור לדעוך עקב הלבנת פוטואורסצנטיות במהלך תקופת ההדמיה. מגוון גרסאות חלבון פלואורסצנטיות נוצרו והושוו להתאמה להדמיית vivo/ex vivo/ex vivo11 המבוססת על בהירות ופוטוסטיות. שנית, החלבונים הפלואורסצנטיים (XFPs) חייבים לבוא לידי ביטוי ברמות גבוהות מספיק בשלב המוקדם ביותר של מורפוגנזה דנדריט, כך שהחלון ההתפתחותי הצר לא יוחמץ. בניתוחים של נקודות זמן סטטיות ברשתית העכבר, התפתחות דנדריט מתרחשת במהלך השבוע הראשון שלאחר הלידה וכוללת שלבים של צמיחה, שיפוץ וייצוב10,12,13,14,15. שלישית, השיטה צריכה להוביל תיוג סלקטיבי או להסתברות מוגברת של תיוג של תת האוכלוסייה העצבית של עניין. רביעית, תיוג של אוכלוסיית המשנה של היעד חייב להיות דליל מספיק, כך שניתן יהיה לזהות את הארבור העצבי כולו ולעקוב אחריו. למרות שתת-סוגים של משמרות המהפכה ואמקרין יכולים להיות מובחנים על ידי המאפיינים המורפולוגיים הבוגרים שלהם ודפוסי ריבוד IPL16,17,18,19,20, האתגר הוא לזהות תת-סוגים במהלך הפיתוח המבוססים על מבנים לא בוגרים. משימה זו מתאפשרת על ידי הרחבת כלים מהונדסים לתייג סוגי תאים ספציפיים ברשתית במהלך הפיתוח.
קווי עכבר מהונדסים ונוק-אין שבהם ביטוי תאי וטמפורלי של חלבונים פלואורסצנטיים או Cre נקבע על ידי אלמנטים רגולטוריים גנטיים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור סוגי תאי רשתית13,21,22,23. תצפיות מפתח על דפוסים ספציפיים תת-סוג של התפתחות דנדריט הגיעו ממחקרים של רשתות עכבר מהונדסות בנקודות זמן סטטיות10,14,24,25. מערכת Cre-Lox, בפרט, מאפשרת מניפולציה וניטור גנים מעולים של תת-סוגים באמצעות מגוון כתבים, חיישנים ומפעילים אופטוגנטיים תלויי רקומבינאז. כלים אלה הובילו לתגליות של תוכניות מולקולריות ספציפיות לתת-סוג ומאפיינים פונקציונליים העומדים בבסיס הרכבת מעגל רשתית26,27,28,29,30. עם זאת, הם עדיין לא להיות ממונפים ללמוד דינמיקה דנדריט ספציפית תת סוג ברשתית העכבר. תיוג בצפיפות נמוכה ניתן להשיג על ידי שילוב קווי עכבר Cre עם טרנסג’נים שהוצגו על ידי אלקטרופורציה או על ידי AAVs רקומביננטי. אם זמין, טמוקסיפן-inducable Cre קווים או אסטרטגיות גנטיות הצטלבות ניתן להשתמש גם. לבסוף, התא צריך להיות מתויג באופן זעיר פולשני ותמונה באמצעות פרמטרי רכישה כדי לא לסכן את הרקמה או להפריע לתפקוד התאי הנדרש עבור מורפוגנזה דנדריט.
מוצגת כאן שיטה ליישם כלים מהונדסים ומיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור את הדינמיקה של דנדריט ברשתית חיה. קווי עכבר מהונדסים Cre שולבו עם וקטורים AAV המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים על recombination Cre, המאפשר תיוג דליל של תאי רשתית של עניין. AAVs זמין מסחרית מועברים לרשתית היילוד על ידי זריקות intravitreal. מאמר זה מדגים כי AAVs לייצר ביטוי פלואורסצנטי גבוה באופן משמעותי סוג התא על ידי 4 dpi, המאפשר גישה לנקודות זמן לאחר הלידה. כדי להמחיש גישה זו, cholinergic “starburst” amacrine interneuron תויג על ידי מתן Brainbow AAV בעכברים יילודים המבטאים את כולין acetyltransferase (ChAT)-אתר הכניסה לריבוזום פנימי (IRES)-Cre transgene, אשר פעיל ברשתית שלאחר הלידה המוקדמת31,32. תאי amacrine Starburst לפתח מורפולוגיה ארבור סטריאוטיפית רדיאלית כי הוא מעוצב על ידי דנדריט הימנעות עצמית בתיווך protocadherins מקובצים33,34. מאמר זה מראה כי הרזולוציה של דנדריטים starburst ו filopodia משופרת באופן משמעותי על ידי XFPs לקרום הפלזמה עם תוספת של מוטיב CAAX אשר עובר farnesylation, כפי המשמש Brainbow AAVs31. לבסוף, נקבעו פרוטוקולי הדמיה ופוסט-עיבוד של זמן המייצרים תמונות באיכות גבוהה הניתנות לשחזור דנדריט וכימות מורפומטרי. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לזהות גורמים השולטים מורפוגנזה דנדריט וכדי ללכוד כמה התנהגויות תאיות ברשתית שלמה.
וידאו זה מדגים צינור ניסיוני המשתמש בכלים גנטיים קיימים כדי לדמיין דינמיקה של דנדריט של פיתוח נוירונים ברשתית עם הדמיה חיה קונפוקלית. כמו כן הוכחו זריקות תוך עיניות של AAVs תלויי Cre קידוד חלבונים פלואורסצנטיים ממוקדי ממברנה לעכברים יילודים. תאים בודדים של אוכלוסיות ממוקדות גנטית מסומנים ב?…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים למדיסון גריי על שעזרה לי כשלא היה לי. מחקר זה נתמך על ידי מענק גילוי NSERC (RGPIN-2016-06128), מלגת סלואן במדעי המוח ויו”ר מחקר קנדה רובד 2 (ל- J.L.L. ). ס. אינג-אסטבס נתמך על ידי תוכנית המחקר למדעי הראייה ומלגות לתואר שני של NSERC- דוקטורט.
Addgene viral prep #45185-AAV9 | |||
Addgene viral prep #45186-AAV9 | |||
Dissection tools | |||
Cellulose filter paper | Whatman | 1001-070 | |
Dumont #5 fine forceps | FST | 11252-20 | Two Dumont #5 forceps are required for retinal micro-dissection |
Dumont forceps | VWR | 82027-426 | |
Fine Scissors | FST | 14058-09 | |
Mixed cellulose ester membrane (MCE) filter papers, hydrophilic, 0.45 µm pore size | Millipore | HABG01 300 | |
Petri Dish, 50 × 15 mm | VWR | 470313-352 | |
Polyethylene disposable transfer pipette | VWR | 470225-034 | |
Round tip paint brush, size 3/0 | Conventional art supply store | Two size 3/0 paint brushes (or smaller) are required for retinal flat-mounting | |
Surgical Scissors | FST | 14007-14 | |
Vannas Spring Scissors – 2.5 mm Cutting Edge | FST | 15000-08 | |
Live-imaging incubation system | |||
Chamber polyethylene tubing, PE-160 10' | Warner Instruments | 64-0755 | |
Dual channel heater controller, Model TC-344C | Warner Instruments | 64-2401 | |
HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR dipping objective | Leica | 15506374 | |
Heater controller cable | Warner Instruments | CC-28 | |
Large bath incubation chamber with slice support | Warner Instruments | RC-27L | |
MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 70-2027 | |
PM-6D Magnetic Heated Platform (incubation chamber heater) | Warner Instruments | PM-6D | |
Pump Head Tubing Pieces For MPII Mini-Peristaltic Pump | Harvard Apparatus | 55-4148 | |
Sample anchor (Harps) | Warner Instruments | 64-0260 | Sample anchor must be compatible with incubation chamber |
Sloflo In-line Solution Heater | Warner Instruments | SF-28 | |
Neonatal Injections | |||
10 µL Microliter Syringe Series 700, Removable Needle | Hamilton Company | 80314 | |
30 G Hypodermic Needles (0.5 inch) | BD PrecisionGlide | 305106 | |
4 inch thinwall glass capillary, no filament (1.0 mm outer diameter/0.75 mm) | WPI World Precision Instruments | TW100-4 | |
Ethanol 99.8% (to dilute to 70% with double-distilled water [ddH2O]) | Sigma-Aldrich | V001229 | |
AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF | Penn Vector Core | AV-9-PV2453 | Addgene Plasmid #45185 |
AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox.WPRE.hGH-InvCheTF |
Penn Vector Core | AV-9-PV2454 | Addgene Plasmid #45186 |
ChAT-IRES-Cre knock-in transgenic mouse line | The Jackson Laboratory | 6410 | |
Fast Green FCF Dye content ≥85 % | Sigma-Aldrich | F7252-25G | |
Flaming/Brown Micropipette Puller, model P-97 | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Green tattoo paste | Ketchum MFG Co | 329A | |
Phosphate-Buffered Saline, pH 7.4, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma-Aldrich | 806552 | |
Pneumatic PicoPump | WPI World Precision Instruments | PV-820 | |
Oxygenated artifiial cerebrospinal fluid (aCSF) Reagents | |||
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C7902 | |
Carbogen (5% CO2, 95% O2) | AirGas | X02OX95C2003102 | Supplier may vary depending on region |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
HEPES, Free Acid | Bio Basic | HB0264 | |
Hydrochloric acid solution, 1 N | Sigma-Aldrich | H9892 | |
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma-Aldrich | M2670 | |
pH-Test strips (6.0-7.7) | VWR | BDH35317.604 | |
Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Sodium chloride (NaCl) | Bio Basic | DB0483 | |
Sodium phosphate monobasic (NaH2PO4) | Sigma-Aldrich | RDD007 | |
Software | |||
ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | Open source |