Detta protokoll beskriver hur man studerar alla möjliga kombinationer som kan erhållas mellan fyra läkemedel i ett enda experiment. Denna metod är baserad på standardanalysen för mikrospädning av 96-brunnar och beräkningen av fraktionerade hämmande koncentrationer (FIC) för att utvärdera resultaten.
Begreppet läkemedelskombinationsterapi blir mycket viktigt främst med den drastiska ökningen av resistens mot droger. Quadruple schackbräde, även kallad Q-checkerboard, syftar till att maximera antalet möjliga kombinationer som kan erhållas mellan fyra läkemedel i ett experiment för att minimera den tid och det arbete som behövs för att uppnå samma resultat med andra protokoll. Detta protokoll är baserat på den enkla mikroutspädningstekniken där läkemedlen späds ut och kombineras i flera 96-brunnsplattor.
I den första uppsättningen 96-brunnsplattor tillsätts Muller-Hinton buljong följt av det första nödvändiga läkemedlet (t.ex. Cefotaxime här) för att seriellt späda ut det. När det första steget är klart används en annan uppsättning 96-brunnsplattor för att späda ut det andra läkemedlet (t.ex. Amikaci), som kommer att överföras genom att ta bort en specifik volym läkemedel 2 och sätta i motsvarande brunnar i den första uppsättningen 96-brunnsplattor som innehåller läkemedel. Det tredje steget görs genom att lägga till de nödvändiga koncentrationerna av det tredje läkemedlet (t.ex. Levofloxacin), till lämpliga plattor i den ursprungliga uppsättningen som innehåller en kombination av läkemedel 1 och 2. Det fjärde steget görs genom att lägga till de nödvändiga koncentrationerna av det fjärde läkemedlet (t.ex. Trimethoprim-sulfamethoxazol) i lämpliga plattor i den första uppsättningen. Sedan kommer E. coli ESBL bakteriell inokulat att beredas och tillsättas.
Denna metod är viktig för att utvärdera alla möjliga kombinationer och har ett bredare utbud av möjligheter att testas ytterligare för in vivo-testning. Trots att det är en tröttsam teknik som kräver mycket fokus är resultaten anmärkningsvärda och tidsbesparande där många kombinationer kan testas i ett enda experiment.
Med ökningen av resistens på grund av överanvändning och missbruk av antibiotika1,2, har behovet av att utveckla nya läkemedel och medel för att behandla bakteriella infektioner blivit avgörande. Nya metoder som att utveckla nya läkemedel är mycket viktiga för att övervinna motståndskrisen. Läkemedelsindustrin är dock inte intresserad av att utveckla nya antimikrobiella medel. Dessutom, om nya läkemedel utvecklas, kommer bakterier att fortsätta att utveckla och utveckla resistens mot dessa nya läkemedel3,4. Således kommer problemet med resistens inte att lösas, vilket gör behovet av ett annat tillvägagångssätt ett måste som bör övervägas och studeras för att övervinna bakteriell resistens.
Läkemedelskombination är ett mycket viktigt koncept för behandling av bakteriella infektioner främst de som orsakas av multiresistenta patogener5,6. Det minskar behandlingsloppet, minskar den angivna dosen; således minskar toxiciteten hos det givna läkemedlet, hjälper till att minska resistensutvecklingen och på ett sätt sensibiliserar bakterierna till de givna läkemedlen enligt beskrivningen i begreppet säkerhetskänslighet5,7,8,9.
Resistensutveckling mot ett läkemedel kräver en enda mutation; Resistensutveckling till en kombination av läkemedel som riktar sig mot flera vägar kräver dock flera oberoende mutationer som bromsas av denna kombination. Ett exempel på minskad resistens vid användning av kombinationsbehandling är den minskade resistensfrekvensen mot Rifampin vid Mycobacterium Tuberculosis10. Ett annat exempel är en studie gjord av Gribble et al. som visade att uppkomsten av resistenta stammar hos patienter som tar Piperacillin ensam är högre än hos dem som tar en kombination av karboxypenicillin och aminoglykosid10. Studier har visat att resistensutveckling mot aminoglykosider hos framväxande bakterier gjorde dessa stammar känsliga för olika andra läkemedel5. Kombinationen mellan beta-laktamklass läkemedlet amoxicillin och laktamashämmaren clavulanic syra visade framgång vid behandling av resistenta bakteriestammar8.
Att minska behandlingstiden är en bra fördel till följd av läkemedelskombinationer. Till exempel kommer en behandling av kombinerat penicillin eller ceftriaxon med gentamicin i 2 veckor att ge samma effekt som ges enbart av penicillin eller ceftriaxon när det ges i 4 veckor11. Att kombinera droger möjliggör användning av lägre doser av läkemedel som inte är effektiva när de ges ensamt såsom sub-MICs. Exemplet med sulfonamider kan ges där användningen av trippelsulfonamider vid lägre doser minimerar den toxicitet som produceras som kristallbildning eller kristallluri vid användning av olösliga sulfonamider vid fulla doser12.
Således, minska den angivna dosen och tidpunkten för behandlingen kommer så småningom att minska toxiciteten hos läkemedlen på kroppen. Idén att utveckla metoder för att bedöma samspelet mellan kombinerade läkemedel är mycket viktig. I en studie visade resultaten att kombinationsbehandling är effektivare för behandling av resistenta arter av Acinetobacter och P. aeruginosa8.
Ge droger i kombination
Det finns olika metoder genom vilka vi kan studera läkemedelskombinationer, såsom schackbrädemetoden, metoden för tidsdödskurva och E-testmetoden13. Schackbrädemetoden kan studera alla möjliga kombinationer mellan de två drogerna i fråga i ett experiment självt. Dessutom utvecklades det för att studera en kombination av tre läkemedel14. Nu utvidgar vi detta för att studera en kombination av fyra läkemedel främst för behandling av multiresistenta patogener.
Tidsdödskurvans analys utförs vanligtvis för att testa för bakteriedödande effekten av ett visst läkemedel. Det användes också för att testa för effekten av läkemedelskombinationer där flera läkemedel kombineras vid specifika koncentrationer. Detta protokoll kräver beredning av flera sterila rör eller koppar där vi i varje kopp lägger till buljongen, kombinationen av droger och den nödvändiga bakteriestammen. Efter inkubation och registrering av den optiska densiteten vid flera tidpunkter jämförs resultaten med den normala tillväxttakten för den använda stammen för att se om tillväxttakten ökade, minskade eller inteändrades 13.
E-testmetod görs vanligtvis för att testa för den minimala hämmande koncentrationen (MIC) där en remsa som innehåller en gradientkoncentration av läkemedlet i fråga sätts på en inokulerad platta. Det användes också för att testa kombinationen mellan två droger där två remsor läggs till plattan på ett vinkelrätt sätt som skär vid deras MIC13.
Enligt litteraturen finns det ingen guldstandard att definiera och studera synergi; Således är det svårt att bedöma vilken av metoderna som används för att studera kombinationen är bättre och vilken som ger bättre och mer tillförlitliga resultat främst13. Tidsdödsanalys är dock arbetsintensiv, tidskrävande och dyr15,16, medan E-testmetoden utvecklas för att studera en kombination mellan endast två läkemedel. Checkerboard kan studera alla möjliga kombinationer mellan de två testade drogerna och det är därför denna teknik har valts för att utvecklas.
Quadruple Checkerboard-metoden liknar schackbrädet och den tredimensionella schackbrädet i protokollet. Vissa avgörande åtgärder bör dock beaktas för att undvika fel under försöket.
Se till att testa för MIC för varje läkemedel mot det testade isolatet innan du börjar protokollet för att veta vilka koncentrationer som behövs för att starta utspädningarna med för läkemedel 1 och läkemedel 2 som måste seriellt spädas i plattorna. När det gäller läkemedel 3 och läkemedel…
The authors have nothing to disclose.
ingen.
1000 µL tips | Citotest | 4330000402 | |
200 µL tips | Citotest | 4330-0013-17 | |
50 mL centrifuge tube | corning | 430828 | For drug 3 and 4 preparation |
5 mL polysterene round-bottom Tube | Falcon | 352058 | For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation |
90mm petri dishes | JRZ Plastilab | As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette | |
96-well plates | corning | 3596 | For serial diltuion and combining drugs |
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole | By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France | 10177403 | Drug 4 |
Ceforane, 1 g (Cefotaxime) | PHARCO Pharmaceuticals | 24750/2006 | Drug 1 |
Densitometer | |||
E. Coli ESBL strain | Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon | Bacterial strain | |
Mac Conkey + crystal violet agar | BIO-RAD | 64169508 | For making agar plates used for subculturing |
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin) | HIKMA Pharmaceuticals | 2BXMIA56N-AEF | Drug 2 |
Muller-Hinton Broth | BIO-RAD | 69444 | For making bacterial media |
Multichannel Pipette | Thermo Scientific | GJ54761 | For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs |
Paper Tape | |||
Single Channel pipettes | Thermo Scientific | OH19855 HH40868 | For the addition of media, bacteria and drugs |
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin) | sanofi aventis | 221937/2009 | Drug 3 |