Détermination des classes totales de lipides et de lipides dans les échantillons marins
Summary
Ce protocole est destiné à la détermination des lipides dans l’eau de mer et les spécimens biologiques. Les lipides dans les filtrats sont extraits avec du chloroforme ou des mélanges de chloroforme et de méthanol dans le cas des solides. Les classes de lipides sont mesurées par chromatographie sur couche mince de bâtonnets avec détection par ionisation de flamme et leur somme donne la teneur totale en lipides.
Abstract
Les lipides sont en grande partie composés de carbone et d’hydrogène et, par conséquent, fournissent une énergie spécifique plus grande que les autres macromolécules organiques dans la mer. Étant riches en carbone et en hydrogène, ils sont également hydrophobes et peuvent agir comme un solvant et un vecteur d’absorption pour les contaminants organiques et peuvent donc être des moteurs de la bioaccumulation des polluants dans les écosystèmes marins. Leur nature hydrophobe facilite leur isolement de l’eau de mer ou des spécimens biologiques : l’analyse des lipides marins commence par l’échantillonnage puis l’extraction dans des solvants organiques non polaires, fournissant une méthode pratique pour leur séparation des autres substances dans une matrice aquatique.
Si de l’eau de mer a été échantillonnée, la première étape consiste généralement à la séparation en factions « dissoutes » et « particulaires » définies opérationnellement par filtration. Les échantillons sont prélevés et les lipides isolés de la matrice de l’échantillon généralement avec du chloroforme pour la matière vraiment dissoute et les colloïdes, et avec des mélanges de chloroforme et de méthanol pour les solides et les échantillons biologiques. Ces extraits peuvent contenir plusieurs classes provenant de sources biogéniques et anthropiques. À ce stade, les lipides totaux et les classes de lipides peuvent être déterminés. Les lipides totaux peuvent être mesurés en additionnant les classes de lipides déterminées individuellement qui ont généralement été séparées chromatographiquement. La chromatographie sur couche mince (TLC) avec détection par ionisation de flamme (FID) est régulièrement utilisée pour l’analyse quantitative des lipides provenant d’échantillons marins. TLC-FID fournit des informations synoptiques sur les classes lipidiques et, en additionnant les classes, une mesure totale des lipides.
Les informations sur la classe des lipides sont particulièrement utiles lorsqu’elles sont combinées avec des mesures de composants individuels, par exemple des acides gras et / ou des stérols, après leur libération à partir d’extraits lipidiques. La grande variété de structures et de fonctions lipidiques signifie qu’elles sont largement utilisées dans la recherche écologique et biogéochimique évaluant la santé des écosystèmes et le degré d’influence des impacts anthropiques. Ils ont été utilisés pour mesurer les substances ayant une valeur alimentaire pour la faune marine (p. ex., les aliments aquatiques et/ou les proies) et comme indicateur de la qualité de l’eau (p. ex., hydrocarbures).
Introduction
Les méthodes décrites ici concernent des substances qui sont définies opérationnellement comme des lipides marins. Cette définition est basée sur leur aptitude à l’extraction liquide-liquide dans des solvants organiques non polaires, et elle fournit une méthode pratique pour leur séparation des autres substances dans une matrice aquatique. Leur nature hydrophobe facilite leur isolement de l’eau de mer ou des spécimens biologiques, ainsi que leur enrichissement et l’élimination des sels et des protéines.
La mesure de la teneur en lipides et de sa composition dans les organismes marins présente un grand intérêt pour l’écologie du réseau trophique, la nutrition aquacole et la science alimentaire depuis des décennies. Les lipides sont des composants universels dans les organismes vivants, agissant comme des molécules essentielles dans les membranes cellulaires, comme des sources majeures d’énergie biodisponible, fournissant une isolation thermique et une flottabilité, et servant de molécules de signalisation. Bien que les procédures de détermination des lipides dans d’autres domaines aient été bien décrites, leur utilisation avec des échantillons marins nécessite généralement des modifications pour s’adapter aux conditions de terrain ainsi qu’au type d’échantillon1.
Pour les échantillons d’eau de mer, la première étape nécessite généralement une séparation en fractions « dissoutes » et « particulaires » définies opérationnellement, normalement par filtration (étape 1 du protocole). La fraction particulaire est ce qui est retenu par le filtre, et la taille des pores est importante dans la définition de la coupure2. Souvent, lorsque nous échantillonnons des particules, nous aimerions établir un lien entre les concentrations lipidiques et les concentrations massiques totales, auquel cas un échantillon distinct et plus petit (p. ex., 10 mL) doit être prélevé à cette fin (étape 1 du Protocole, note). Pour obtenir une détermination précise de la masse, il est important d’ajouter du formiate d’ammonium (35 g/L) à la fin de la filtration.
Le filtrat d’eau de mer de l’échantillon le plus grand doit représenter entre 250 mL et 1 L selon le type d’échantillon et est soumis à une extraction liquide-liquide dans un entonnoir séparateur (étape 2 du protocole). La nature hydrophobe des lipides signifie qu’ils peuvent être séparés des autres composés par extraction dans un solvant non polaire tel que le chloroforme. Un système à deux couches est créé où les lipides se divisent en couche organique tandis que les composants solubles dans l’eau restent dans la couche aqueuse.
Les échantillons de particules sur un filtre, ou les échantillons biologiques sont extraits avec une extraction modifiée de Folch et al.3, impliquant également du chloroforme (étape 3 du protocole). Encore une fois, un système organique / aqueux est créé dans lequel les lipides se divisent en phase organique, tandis que les molécules solubles dans l’eau restent dans la phase aqueuse et que les protéines sont précipitées. En fait, pour les solides, la plupart des laboratoires utilisent une variante de la procédure d’extraction Folch et al.3 impliquant du chloroforme et du méthanol. Pour les filtres, la première étape consiste à homogénéiser en 2 mL de chloroforme et 1 mL de méthanol.
Pendant l’extraction, il faut veiller à protéger les lipides des modifications chimiques ou enzymatiques, en conservant les échantillons et les solvants sur la glace pour réduire l’hydrolyse des liaisons ester ou l’oxydation à double liaison carbone-carbone. Les tissus et les lipides cellulaires sont assez bien protégés par des antioxydants naturels et par compartimentation4; cependant, à la suite de l’homogénéisation des échantillons, le contenu cellulaire est combiné, ce qui rend les lipides plus disposés à l’altération, chimiquement ou enzymatiquement. Certains lipides, comme la plupart des stérols, sont très stables, tandis que d’autres, comme ceux contenant des acides gras polyinsaturés, sont plus sensibles à l’oxydation chimique. D’autres, comme les stérols à doubles liaisons conjuguées, sont sujets à l’oxydation catalysée par la lumière5. Après les extractions, les lipides sont beaucoup plus sensibles à l’oxydation chimique et les échantillons doivent être stockés sous un gaz inerte tel que l’azote. Un doux flux d’azote serait également utilisé pour concentrer les extraits.
Après concentration, les lipides seraient alors normalement quantifiés en vrac car ils constituent un composant important des écosystèmes marins fournissant une forte concentration d’énergie, plus de deux fois le kJ / g de glucides et de protéines. Invariablement, ils seraient ensuite quantifiés en tant que composants individuels: l’analyse complète des lipides implique généralement une séparation en catégories plus simples, en fonction de leur nature chimique. Ainsi, une analyse complète implique de mesurer les lipides totaux, les classes de lipides et les composés individuels.
Le lipide total peut être déterminé en prenant la somme des classes de lipides mesurées individuellement séparées par chromatographie6. Un extrait lipidique marin peut contenir plus d’une douzaine de classes provenant de sources biogéniques et anthropiques. La grande variété de structures lipidiques signifie que beaucoup d’informations peuvent être obtenues en déterminant des groupes individuels de structures. Des classes de lipides individuellement, ou dans certains groupes, ont été utilisées pour signaler la présence de certains types d’organismes, ainsi que leur état physiologique et leur activité2. Ils ont également été utilisés comme indicateur de l’origine des matières organiques, y compris la matière organique dissoute (DOM) ainsi que les contaminants hydrophobes.
Les triacylglycérols, les phospholipides et les stérols font partie des classes de lipides biogéniques les plus importantes. Les deux premiers sont biochimiquement liés car ils possèdent une colonne vertébrale de glycérol à laquelle deux ou trois acides gras sont estérifiés (Figure 1). Les triacylglycérols, ainsi que les esters de cire sont des substances de stockage très importantes, tandis que d’autres classes de lipides contenant des acides gras tels que les diacylglycérols, les acides gras libres et les monoacylglycérols sont généralement des constituants mineurs. Les acides gras libres sont présents à des concentrations plus faibles dans les organismes vivants, car les acides insaturés peuvent être toxiques7. Les stérols (à la fois sous leur forme libre et estérifiée) et les alcools gras sont également inclus parmi les lipides les moins polaires, tandis que les glycolipides et les phospholipides sont des lipides polaires. Les lipides polaires ont un groupe hydrophile, ce qui permet la formation de bicouches lipidiques présentes dans les membranes cellulaires. Les stérols libres sont également des composants structurels membranaires, et lorsqu’ils sont pris en rapport avec les triacylglycérols, ils fournissent une condition ou un indice nutritionnel (TAG: ST) qui a été largement utilisé8. Lorsqu’ils sont pris en rapport aux phospholipides (ST : PL), ils peuvent être utilisés pour indiquer la sensibilité des plantes au sel: des valeurs plus élevées maintiennent l’intégrité structurelle et diminuent la perméabilité membranaire9. L’inverse de ce rapport (PL : ST) a été étudié dans les tissus bivalves lors de l’adaptation à la température10.
Les classes de lipides marins peuvent être séparées par chromatographie sur couche mince (TLC) sur des tiges revêtues de gel de silice (étape 4 du protocole), puis détectées et quantifiées par détection par ionisation de flamme (FID) dans un scanner FID automatique. Le TLC/FID est devenu couramment utilisé pour les échantillons marins car il fournit rapidement des données synoptiques sur les classes lipidiques à partir de petits échantillons et, en prenant la somme de toutes les classes, une valeur pour les lipides totaux. Le TLC/FID a fait l’objet d’une évaluation de l’assurance de la qualité (AQ) et s’est avéré conforme aux normes requises pour un étalonnage externe cohérent, des blancs faibles et une analyse de réplication précise11. Les coefficients de variation (CV) ou les écarts-types relatifs sont d’environ 10 %, et les données lipidiques totales du scanner FID sont normalement d’environ 90 % de celles obtenues par gravimétrie et d’autres méthodes2. La gravimétrie donne des lipides totaux plus élevés probablement parce que le scanner FID ne mesure que des composés non volatils, et aussi à la suite de l’inclusion possible de matériau non lipidique dans les mesures gravimétriques.
Les informations fournies par l’analyse de la classe lipidique sont particulièrement utiles lorsqu’elles sont combinées avec des déterminations d’acides gras en tant qu’individus, ou de stérols, ou les deux en combinaison. La première étape vers ces analyses implique la libération de tous les acides gras constitutifs ainsi que des stérols dans les extraits lipidiques (étape 5 du protocole). La grande variété de structures et de fonctions lipidiques signifie qu’ils ont été largement utilisés dans les études écologiques et biogéochimiques évaluant la santé des écosystèmes et la mesure dans laquelle ils ont été influencés par les apports anthropiques et terrestres. Ils ont été utilisés pour mesurer la biosynthèse de substances ayant une valeur alimentaire pour la faune marine ainsi que pour indiquer la qualité des échantillons d’eau. La mesure des lipides dans les carottes de sédiments aide à montrer la sensibilité des sédiments aux changements dans l’utilisation des terres par l’homme près de la marge terre-mer.
Le principal outil d’identification et de quantification des composés lipidiques individuels est traditionnellement la chromatographie en phase gazeuse (CG) avec FID. Avant l’analyse cependant, ces composés sont rendus plus volatils par la dérivatisation. Les acides gras sont libérés en présence d’un catalyseur acide(H2SO4)à partir de classes de lipides acyliques(Figure 1). En chimie organique, le groupe acyle (R-C=O) est généralement dérivé d’un acide carboxylique (R-COOH). Ils sont ensuite réestérifiés en esters méthyliques d’acides gras (FAME) ce qui donne de meilleures séparations sur les colonnes GC (étape 5 du protocole).
Protocol
Representative Results
Discussion
La rapidité avec laquelle le système TLC-FID fournit des informations synoptiques sur la classe des lipides à partir de petits échantillons fait du TLC-FID un outil capable de filtrer les échantillons marins avant d’entreprendre des procédures analytiques plus complexes. De telles analyses nécessitent généralement la libération de composés constitutifs à partir d’extraits lipidiques et la dérivatisation pour augmenter la volatilité dans le cas de la chromatographie en phase gazeuse. TLC-FID combiné ave…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CNSR) numéro 105379 à C.C. Parrish. Le réseau CREAIT (Core Research Equipment & Instrument Training) de l’Université Memorial a contribué au financement de cette publication.
Materials
| 15 ml vials | VWR | 66009-560 | |
| 1-hexadecanol | Sigma | 258741-1G | |
| 1-Monopalmitoyl-rac-glycerol | Sigma | M1640-1g | |
| 2 ml vials | VWR | 46610-722 | |
| 25 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32A | |
| 2ml pipet bulbs | VWR | 82024-554 | |
| 47 mm glass fibre filters | Fisher | 09 874 32 | |
| 5 3/4" pipets | Fisher | 1367820A | |
| 9" pipets | Fisher | 1367820C | |
| Acetone | VWR | CAAX0116-1 | |
| Agilent GC-FID 6890 | Agilent | ||
| Calcium Chloride ANHS 500gm | VWR | CACX0160-1 | |
| Caps for 2 ml vials | VWR | 46610-712 | |
| chloroform | VWR | CACX1054-1 | |
| Cholesteryl palmitate | Sigma | C6072-1G | |
| Chromarod S5 | Shell USA | 3252 | |
| Dichloromethane | VWR | CADX0831-1 | |
| DL-a-phosphatidylcholine, dipalmotoyl | Sigma | P5911-1g | |
| Ethyl Ether, ACS grade anhydr 4L | VWR | CAEX0190-4 | |
| Glyceryl tripalmitate | Sigma | T5888-100MG | |
| Hamilton Syringe 702SNR 25µl | Sigma | 58381 | |
| Helium | Air Liquide | A0492781 | |
| Hexane | VWR | CAHX0296-1 | |
| Hydrogen regulator | VWR | 55850-484 | |
| Iatroscan MK6 | Shell USA | ||
| Kimwipes | Fisher | 066662 | |
| Medical Air | Air Liquide | A0464563 | |
| Medium nitrile gloves | Fisher | 191301597C | |
| Nitrile gloves L | VWR | CA82013-782 | |
| Nitrogen | Air Liquide | A0464775 | |
| Nitrogen Regulator | VWR | 55850-474 | |
| Nonadecane | Sigma | 74158-1G | |
| Palmitic acid | Sigma | P0500-10G | |
| Repeating dispenser | Sigma | 20943 | |
| Sodium Bicarbonate 1kg | VWR | CA97062-460 | |
| Sodium Sulfate Anhy ACS 500gr | VWR | CA71008-804 | |
| Sulfuric acid | VWR | CASX1244-5 | |
| Teflon tape | Fisher | 14610120 | |
| tissue master 125 115V w/7mm homogenator | OMNI International | TM125-115 | |
| TLC development tank | Shell USA | 3201 | |
| UHP hydrogen | Air Liquide | A0492788 | |
| VWR solvent repippetter | VWR | 82017-766 | |
| VWR timer Flashing LED 2 channel | VWR | 89140-196 | |
| Zebron ZB-Wax GC column | Phenomenex | 7HM-G013-11 |
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