Denne rapport beskriver teknikker til at isolere og rense sulfat glycosaminoglycaner (GAGs) fra biologiske prøver og en polyacrylamidgelelektroforesetilgang for at tilnærme deres størrelse. GAG’er bidrager til vævsstruktur og påvirker signalprocesser via elektrostatisk interaktion med proteiner. GAG polymer længde bidrager til deres bindende affinitet for cognate ligands.
Sulfat glycosaminoglycans (GAGs) såsom heparan sulfat (HS) og chondroitin sulfat (CS) er allestedsnærværende i levende organismer og spiller en afgørende rolle i en række grundlæggende biologiske strukturer og processer. Som polymerer findes GAG’er som en polydisperseblanding, der indeholder polysaccharidkæder, der kan variere fra 4000 Da til langt over 40.000 Da. Inden for disse kæder findes områder af sulfatering, hvilket giver et mønster af negativ ladning, der letter interaktionen med positivt ladede rester af cognate protein ligands. Sulfaterede områder af GAG’er skal være af tilstrækkelig længde til at muliggøre disse elektrostatiske interaktioner. For at forstå funktionen af GAGs i biologiske væv, investigator skal være i stand til at isolere, rense, og måle størrelsen af GAGs. Denne rapport beskriver en praktisk og alsidig polyacrylamidgel elektroforese-baseret teknik, der kan udnyttes til at løse relativt små forskelle i størrelse mellem GAGs isoleret fra en række biologiske vævstyper.
Glycosaminoglycans (GAGs) er en forskelligartet familie af lineære polysaccharider, der er et allestedsnærværende element i levende organismer og bidrager til mange grundlæggende fysiologiske processer1. GAG’er som heparansulfat (HS) og chondroitin sulfat (CS) kan sulfateres i forskellige positioner langs polysaccharidkæden, der giver geografiske domæner af negativ ladning. Disse GAGs, når tøjret til celle-overflade proteiner kendt som proteoglycaner, projekt i ekstracellulære rum og binde sig til cognate ligands, giver mulighed for regulering af både cis- (ligand knyttet til den samme celle) og trans- (ligand knyttet til nabocelle) signalering processer2. Desuden udfører GAG’er også kritiske roller som strukturelle elementer i væv som den glomerulære kældermembran3, den vaskulære endotelglyks4 og lungeehelleleglyks5og i bindevæv sådan brusk6.
Længden af GAG polysaccharidkæder varierer betydeligt alt efter dens biologiske kontekst og kan forlænges dynamisk, spaltes og ændres af et meget komplekst enzymatisk reguleringssystem7. Det er vigtigt, at længden af GAG-polymerkæder bidrager væsentligt til deres bindende affinitet for ligands og efterfølgende til deres biologiske funktion8,9. Af denne grund kræver bestemmelse af funktionen af en endogen GAG en vurdering af dens størrelse. Desværre findes der i modsætning til proteiner og nukleinsyrer meget få let tilgængelige teknikker til at opdage og måle GAG’er, hvilket historisk har resulteret i relativt begrænset undersøgelse af de biologiske roller i denne forskelligartede polysaccharidfamilie.
Denne artikel beskriver, hvordan man isolerer og renser GAGs fra de fleste biologiske væv, og beskriver også, hvordan man bruger polyacrylamidgelelektroforese (PAGE) til at vurdere længden af de isolerede polymerer med en rimelig grad af specificitet. I modsætning til andre, meget komplekse (og ofte massespektrometribaserede) glykomiske tilgange kan denne metode anvendes ved hjælp af standard laboratorieudstyr og -teknikker. Denne praktiske tilgang kan derfor udvide efterforskernes evne til at bestemme den biologiske rolle, som indfødte GAG’er spiller, og deres interaktion med kontekstuelt vigtige ligands.
Gag’er spiller en central rolle i mange forskellige biologiske processer. En af de vigtigste funktioner i sulfattede GAG’er (såsom HS og CS) er at interagere med og binde sig til ligands, som kan ændre downstream-signalfunktioner. En vigtig faktor for GAG-bindende affinitet til cognate ligands er længden af GAG polymerkæden 8,9,14. Derfor er det vigtigt for forskere med rimelig præcision at kunne definere størrelsen af GAG…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL og EPS)
Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |