Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent
Summary
Ce rapport décrit des techniques pour isoler et purifier les glycosaminoglycanes sulfatés (GAN) à partir d’échantillons biologiques et une approche d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide pour approximer leur taille. Les GG contribuent à la structure des tissus et influencent les processus de signalisation via l’interaction électrostatique avec les protéines. La longueur du polymère GAG contribue à leur affinité de liaison pour les ligands apparentés.
Abstract
Les glycosaminoglycanes sulfatés (GAG) tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) sont omniprésents dans les organismes vivants et jouent un rôle essentiel dans une variété de structures et de processus biologiques de base. En tant que polymères, les GAG existent sous la forme d’un mélange polydispersé contenant des chaînes de polysaccharides pouvant aller de 4000 Da à plus de 40 000 Da. Au sein de ces chaînes existent des domaines de sulfatation, conférant un modèle de charge négative qui facilite l’interaction avec les résidus chargés positivement de ligands protéiques apparentés. Les domaines sulfatés des GAG doivent être d’une longueur suffisante pour permettre ces interactions électrostatiques. Pour comprendre la fonction des GG dans les tissus biologiques, l’investigateur doit être en mesure d’isoler, de purifier et de mesurer la taille des GG. Ce rapport décrit une technique pratique et polyvalente basée sur l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide qui peut être exploitée pour résoudre des différences de taille relativement faibles entre les GAN isolés à partir d’une variété de types de tissus biologiques.
Introduction
Les glycosaminoglycanes (GAG) sont une famille diversifiée de polysaccharides linéaires qui sont un élément omniprésent dans les organismes vivants et contribuent à de nombreux processus physiologiques de base1. Les GIG tels que le sulfate d’héparane (HS) et le sulfate de chondroïtine (CS) peuvent être sulfatés à des positions distinctes le long de la chaîne polysaccharidique, conférant des domaines géographiques de charge négative. Ces GAG, lorsqu’ils sont attachés à des protéines de surface cellulaire connues sous le nom de protéoglycanes, se projettent dans l’espace extracellulaire et se lient à des ligands apparentés, permettant la régulation des processus de signalisation cis- (ligand attaché à la même cellule) et trans- (ligand attaché à la cellule voisine)2. En outre, les GGA jouent également un rôle essentiel en tant qu’éléments structurels dans des tissus tels que la membrane basale glomérulaire3,le glycocalyx endothélial vasculaire4 et le glycocalyx épithélial pulmonaire5,et dans les tissus conjonctifs tels que le cartilage6.
La longueur des chaînes polysaccharidiques GAG varie considérablement en fonction de son contexte biologique et peut être allongée dynamiquement, clivée et modifiée par un système de régulation enzymatique très complexe7. Il est important de savoir que la longueur des chaînes polymères GAG contribue de manière substantielle à leur affinité de liaison pour les ligands et, par la suite, à leur fonction biologique8,9. Pour cette raison, la détermination de la fonction d’un GAG endogène nécessite une appréciation de sa taille. Malheureusement, contrairement aux protéines et aux acides nucléiques, il existe très peu de techniques facilement disponibles pour détecter et mesurer les GAG, ce qui a historiquement donné lieu à des recherches relativement limitées sur les rôles biologiques de cette famille diversifiée de polysaccharides.
Cet article décrit comment isoler et purifier les GG de la plupart des tissus biologiques et, également, décrit comment utiliser l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) pour évaluer la longueur des polymères isolés avec un certain degré de spécificité. Contrairement à d’autres approches glycomiques très complexes (et souvent basées sur la spectrométrie de masse), cette méthode peut être utilisée à l’aide d’équipements et de techniques de laboratoire standard. Cette approche pratique peut donc élargir la capacité des chercheurs à déterminer le rôle biologique des GG natifs et leur interaction avec des ligands contextuellement importants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les GG jouent un rôle central dans de nombreux processus biologiques divers. L’une des principales fonctions des GAN sulfatés (tels que HS et CS) est d’interagir avec les ligands et de s’y lier, ce qui peut modifier les fonctions de signalisation en aval. Un déterminant important de l’affinité de liaison GAG aux ligands apparentés est la longueur de la chaîne polymère GAG 8,9,14. Pour cette raison, il est importan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL et EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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