Summary

זיהוי של גליקוסמינוגליקנס על ידי אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד וכתמים כסף

Published: February 25, 2021
doi:

Summary

דו”ח זה מתאר טכניקות לבודד ולטהר גליקוסאמינוגליקנים גופרתיים (GAGs) מדגימות ביולוגיות וגישה אלקטרופורזה של ג’ל פוליאקרילמיד בערך בגודלם. GAGs לתרום מבנה רקמות להשפיע על תהליכי איתות באמצעות אינטראקציה אלקטרוסטטית עם חלבונים. אורך פולימר GAG תורם לזיקה המחייבת שלהם לליגנדים קוגנטיים.

Abstract

גליקוסאמינוגליקאנים גופרתיים (GAGs) כגון הפריאן סולפט (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) נמצאים בכל מקום באורגניזמים חיים וממלאים תפקיד קריטי במגוון מבנים ותהליכים ביולוגיים בסיסיים. כפולימרים, GAGs קיימים כתערובת פולידיספרס המכילה שרשראות פוליסכריד שיכולות לנוע בין 4000 Da ליותר מ -40,000 Da. בתוך שרשראות אלה קיימים תחומים של גופרית, המעניקים דפוס של מטען שלילי המאפשר אינטראקציה עם שאריות טעונות חיוביות של ליגנד חלבון קוגנייט. תחומים גופרתיים של GAGs חייב להיות באורך מספיק כדי לאפשר אינטראקציות אלקטרוסטטיות אלה. כדי להבין את הפונקציה של GAGs ברקמות ביולוגיות, החוקר חייב להיות מסוגל לבודד, לטהר, ולמדוד את הגודל של GAGs. דו”ח זה מתאר טכניקה מעשית ורב-תכליתית המבוססת על אלקטרופורזה ג’ל פוליאקרילמיד שניתן למנף כדי לפתור הבדלים קטנים יחסית בגודל בין GAGs מבודדים ממגוון סוגי רקמות ביולוגיות.

Introduction

גליקוסאמינוגליקנס (GAGs) הם משפחה מגוונת של פוליסכרידים ליניאריים שהם יסוד בכל מקום באורגניזמים חיים ותורמים לתהליכים פיזיולוגיים בסיסיים רבים1. GAGs כגון הפריאן גופרתי (HS) וכונדרואיטין סולפט (CS) עשוי להיות גופרתי בעמדות שונות לאורך שרשרת הפוליסכריד, והענקת תחומים גיאוגרפיים של מטען שלילי. GAGs אלה, כאשר קשורים חלבונים פני התא המכונה proteoglycans, להקרין לתוך החלל החוץ תאי ונקשרים ליגנדים מודעים, המאפשר את הרגולציה של שני cis- (ליגנד מחובר לאותו תא) ו trans- (ליגנד מחובר לתא השכן) תהליכי איתות2. יתר על כן, GAGs גם לבצע תפקידים קריטיים כמו אלמנטים מבניים ברקמות כגוןקרוםהמרתף glomerular 3 , גליקוקליקס אנדותל וסקולרי4 וגליקוקליקס אפיתל ריאתי5, וברקמות חיבור כגון סחוס6.

אורך שרשראות הפוליסכריד GAG משתנה באופן משמעותי בהתאם להקשר הביולוגי שלה וניתן להאריך אותו באופן דינמי, לבקע ולשנותו על ידי מערכת רגולטורית אנזימטית מורכבת מאוד7. חשוב לציין, אורך שרשראות הפולימר GAG תורם באופן משמעותי לזיקתן המחייבת לליגנדים, ולאחר מכן לתפקוד הביולוגי שלהם8,9. מסיבה זו, קביעת הפונקציה של GAG אנדוגני דורש הערכה של גודלו. למרבה הצער, שלא כמו חלבונים וחומצות גרעין, מעט מאוד טכניקות זמינות קיימות כדי לזהות ולמדוד GAGs, אשר מבחינה היסטורית הביא חקירה מוגבלת יחסית לתוך התפקידים הביולוגיים של משפחת פוליסכריד מגוונת זו.

מאמר זה מתאר כיצד לבודד ולטהר GAGs מרוב הרקמות הביולוגיות, וגם, מתאר כיצד להשתמש אלקטרופורזה ג’ל polyacrylamide (PAGE) כדי להעריך את אורך הפולימרים המבודדים עם מידה לא מבוטלת של ספציפיות. בניגוד לגישות גליקומוניות אחרות, מורכבות מאוד (ולעתים קרובות מבוססות ספקטרומטריית מסה), ניתן להשתמש בשיטה זו באמצעות ציוד מעבדה וטכניקות סטנדרטיות. גישה מעשית זו עשויה, אם כן, להרחיב את יכולתם של החוקרים לקבוע את התפקיד הביולוגי של GAGs ילידים ואת האינטראקציה שלהם עם ליגנדים חשובים מבחינה הקשרית.

Protocol

כל הדגימות הביולוגיות שניתחו בפרוטוקול זה התקבלו מעכברים, על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קולורדו מוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש בוועדה. 1. בידוד גופרתי של הפרין הזיון של דגימות רקמההערה: הזיון הוא צעד אופציונלי עבור רקמות עשירות בשומן. הפוך…

Representative Results

כחול אלקי משמש להכתמת GAGs גופרית 10; אות זה מוגבר על ידי שימוש בכתם כסף 11לאחר מכן . איור 1 מספק הדגמה חזותית של תהליך פיתוח כתמי הכסף. כפי שהוכח, האות הכחול האלקי המייצג GAGs מופרדים על ידי אלקטרופורזה מוגבר כמו הסוכן המתפתח חודר ג’ל polyacrylamide. בדרך כלל, התה…

Discussion

לגאגים יש תפקיד מרכזי בתהליכים ביולוגיים רבים ומגוונים. אחת הפונקציות העיקריות של GAGs גופרתי (כגון HS ו- CS) היא לקיים אינטראקציה עם ליגנדים ולאגד, אשר יכול לשנות פונקציות איתות במורד הזרם. גורם חשוב של זיקה מחייבת GAG לליגנדים מודעים הוא אורך שרשרת הפולימר GAG 8,9<s…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL ו- EPS)

Materials

Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge thermoFisher Scientific 13-100-675 Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate
Acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP170-100 Electrophoresis grade
Actinase E Sigma Aldrich P5147 Protease mix from S. griseus
Alcian Blue 8GX (solid) thermoFisher Scientific AC400460100
Ammonium acetate (solid) thermoFisher Scientific A639-500 Molecular biology grade
Ammonium hydroxide (liquid) thermoFisher Scientific A669S-500 certified ACS
Ammonium persulfate (solid) thermoFisher Scientific BP179-25 electrophoresis grade
Barnstead GenPure Pro Water Purification System ThermoFisher Scientific 10-451-217PKG Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute
Boric acid (solid) thermoFisher Scientific A73-500 Molecular biology grade
Bromphenol blue (solid) thermoFisher Scientific B392-5
Calcium acetate (solid) ThermoFisher Scientific 18-609-432 Molecular biology grade
Calcium chloride (solid) ThermoFisher Scientific AC349610250 Molecular biology grade
CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) ThermoFisher Scientific 28299
Chondroitinase ABC Sigma Aldrich C3667
Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) Bio-Rad 3459901 Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice
Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) Bio-Rad 1656019 any comparable vertical gel PAGE system will work)
Dichloromethane (liquid) thermoFisher Scientific AC610931000 certified ACS
EDTA disodium salt (solid) thermoFisher Scientific 02-002-786 Molecular biology grade
Glacial acetic acid (liquid) thermoFisher Scientific A35-500 Certified ACS
Glycine (solid) thermoFisher Scientific G48-500 Electrophoresis grade
Heparanase I/III Sigma Aldrich H3917 From Flavobacterium heparinum
Heparin derived decasaccharide (dp10) galen scientific HO10
Heparin derived hexasaccharde (dp6) Galen scientific HO06
Heparin derived oligosaccharide (dp20) galen scientific HO20
Hydrochloric acid (liquid) thermoFisher Scientific A466-250
Lyophilizer Labconco 7752020 Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator
Methanol (liquid) thermoFisher Scientific A412-500 Certified ACS
Molecular Imager Gel Doc XR System Bio-Rad 170-8170 Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute
N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) thermoFisher Scientific BP171-25 Electrophoresis grade
Phenol red (solid) thermoFisher Scientific P74-10 Free acid
Q Mini H Ion Exchange Column Vivapure VS-IX01QH24 Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11
Silver nitrate (solid) thermoFisher Scientific S181-25 certified ACS
Sodium Acetate (solid) ThermoFisher Scientific S210-500 Molecular biology grade
Sodium chloride (solid) thermoFisher Scientific S271-500 Molecular biology grade
Sodium hydroxide (solid) thermoFisher Scientific S392-212
Sucrose (solid) thermoFisher Scientific BP220-1 Molecular biology grade
TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) thermoFisher Scientific BP150-20 Electrophoresis grade
Tris base (solid) thermoFisher Scientific BP152-500 Molecular biology grade
Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff Amicon UFC500324 Larger volume filter units may be used, depending on sample size. 
Urea (solid) ThermoFisher Scientific 29700
Vacufuge Plus Eppendorf 22820001 Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer
Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume thermoFisher Scientific 569-0020 Alternative volumes and filter materials acceptable

References

  1. LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
  2. Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
  3. Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
  4. Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
  5. Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
  6. Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
  7. Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
  8. Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
  9. Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
  10. Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
  11. Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
  12. Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
  13. Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
  14. Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
  15. Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
  16. Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
  17. Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
  18. Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
  19. Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
check_url/fr/62319?article_type=t

Play Video

Citer Cet Article
LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima, K., McMurtry, S. A., Linhardt, R. J., Schmidt, E. P. Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (168), e62319, doi:10.3791/62319 (2021).

View Video