ポリアクリルアミドゲル電気泳動と銀染色によるグリコサミノグリカンの検出
1Department of Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology,Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences,Curtin University, 5Department of Medicine,Denver Health Medical Center
Summary
本報告書では、生物学的試料から硫酸化グリコサミノグリカン(GAG)を分離して精製する技術と、そのサイズを近似するポリアクリルアミドゲル電気泳動法について説明する。GAGsは、組織構造に寄与し、タンパク質との静電相互作用を通じてシグナル伝達プロセスに影響を与えます。GAGポリマー長は、同結合リガンドに対する結合親和性に寄与する。
Abstract
硫酸塩(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などの硫酸塩グリコサミノグリカン(GAG)は、生物に遍在し、様々な基本的な生物学的構造やプロセスにおいて重要な役割を果たしています。ポリマーとして、GAGは4000 Daから40,000 Daをはるかに超える範囲の多糖鎖を含む多分散混合物として存在します。これらの鎖の中には、硫酸化のドメインが存在し、同結合タンパクリガンドの正に帯電した残基との相互作用を促進する負電荷のパターンを与える。GAGsの硫酸化ドメインは、これらの静電相互作用を可能にするのに十分な長さでなければならない。生物学的組織におけるGAGsの機能を理解するには、研究者がGAGsのサイズを単離し、精製し、測定できる必要があります。本報告書は、様々な生体組織タイプから分離されたGAGs間のサイズの比較的小さな違いを解決するために活用できる実用的で汎用性の高いポリアクリルアミドゲル電気泳動ベースの技術について説明しています。
Introduction
グリコサミノグリカン(GAG)は、生物の中でユビキタスな要素であり、多くの基本的な生理学的プロセスに寄与する線形多糖の多様なファミリーである1。ヘパラン硫酸(HS)やコンドロイチン硫酸(CS)などのGAGsは、多糖鎖に沿った異なる位置で硫酸化され、負電荷の地理的領域を付与する。これらのGAGsは、プロテオグリカンとして知られている細胞表面タンパク質に連結すると、細胞外空間に突出してコクネートリガンドに結合し、シス−(同じ細胞に結合したリガンド)およびトランス(隣接する細胞に結合したリガンド)の両方の調節を可能にするシグナル伝達プロセス2。さらに、GGsはまた、糸球体基質膜3、血管内皮グリコカリックス4 および肺上皮グリコカリックス5、および軟骨6のような結合組織における組織における構造要素としての重要な役割を果たす。
GAG多糖鎖の長さは、その生物学的文脈に応じて実質的に異なり、動的に長く、切断し、非常に複雑な酵素調節システム7によって修飾することができる。重要なことに、GAGポリマー鎖の長さは、リガンドに対するそれらの結合親和性に大きく寄与し、その後、その生物学的機能8、9に寄与する。このため、内因性GAGの機能の決定は、そのサイズの鑑賞を必要とする。残念ながら、タンパク質や核酸とは異なり、GAGsを検出して測定するための容易に入手可能な技術はほとんど存在しません。
この記事では、ほとんどの生体組織からGAGを分離して精製する方法を説明し、また、ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)を使用して、分離ポリマーの長さを公正な程度の特異性で評価する方法についても説明します。他の非常に複雑な(そしてしばしば質量分析ベースの)グリコミックアプローチとは対照的に、この方法は標準的な実験室の装置および技術を使用して使用することができる。したがって、この実用的なアプローチは、ネイティブのGAGsの生物学的役割と文脈上重要なリガンドとの相互作用を決定する研究者の能力を拡大する可能性があります。
Protocol
このプロトコルで分析されたすべての生物学的サンプルは、コロラド大学の制度的動物の世話と使用委員会によって承認されたプロトコルの下で、マウスから得られた。 1. ヘパラン硫酸分離 組織サンプルの脱脂注:脱脂は、脂肪が豊富な組織のためのオプションのステップです。 メタノールとジクロロメタンを1:1の混合物にします。サンプ?…
Representative Results
アルシアンブルーは、硫酸化GAGs 10を染色するために使用されます。この信号は、後続の銀染色 11を用いて増幅される。 図1 は、銀染色開発プロセスの視覚的なデモンストレーションを示しています。実証されるように、電気泳動によって分離されたGAGを表すアルシアンブルー信号は、現像剤がポリアクリルアミドゲルに浸透するにつ…
Discussion
GAGsは、多くの多様な生物学的プロセスにおいて中心的な役割を果たしています。硫酸化GAGs(HSやCSなど)の主な機能の1つは、リガンドと相互作用して結合し、下流のシグナル伝達機能を変化させることです。コグネイトリガンドに対するGAG結合親和性の重要な決定要因は、GAGポリマー鎖8、9、14の長さである。 このため、研?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、F31 HL143873-01(WBL)、R01 HL125371(RJLおよびEPS)によって資金提供されました
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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Citer Cet Article
LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima, K., McMurtry, S. A., Linhardt, R. J., Schmidt, E. P. Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (168), e62319, doi:10.3791/62319 (2021).