폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출
1Department of Medicine,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program,University of Colorado Anschutz Medical Campus, 3Department of Chemistry and Chemical Biology,Rensselaer Polytechnic Institute, 4Department of Health Sciences,Curtin University, 5Department of Medicine,Denver Health Medical Center
Summary
이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.
Abstract
헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 황산 글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스이며 다양한 기본적인 생물학적 구조 및 공정에서 중요한 역할을 한다. 폴리머로서 GAG는 4000 Da에서 40,000 Da까지 다양하게 함유된 다당류 체인을 함유하는 다분산 혼합물로 존재합니다. 이러한 사슬 내에는 음전하의 도메인이 존재하며, 이는 cognate 단백질 리간드의 양전하 잔류물과의 상호 작용을 용이하게 하는 음전하 패턴을 부여합니다. GAG의 황질 도메인은 이러한 정전기 상호 작용을 허용하기에 충분한 길이여야 합니다. 생물학적 조직에서 GAG의 기능을 이해하려면 조사원은 GAG의 크기를 분리, 정화 및 측정할 수 있어야 합니다. 이 보고서는 다양한 생물학적 조직 유형에서 분리된 GAGs 간의 크기 차이를 비교적 작은 차이를 해결하기 위해 활용할 수 있는 실용적이고 다재다능한 폴리아크릴아미드 젤 전기포고제 기반 기술을 설명합니다.
Introduction
글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스 원소이며 많은 기본적인생리적과정에 기여하는 선형 다당류의 다양한 가족이다. 헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 GAGs는 다당류 사슬을 따라 뚜렷한 위치에서 황살이 될 수 있으며, 부정적인 전하의 지리적 영역을 부여한다. 이들 GAGs는 프로테오글리칸으로 알려진 세포 표면 단백질에 테더링될 때 세포 외 공간으로 투영하여 코그네이트 리간드에 결합하여 시스-(동일한 세포에 부착된 리간드) 및 트랜스-(이웃 세포에 부착된 리간드) 신호 공정2의조절을 허용한다. 또한, GAGs는 또한 구체 지하 막3,혈관 내피 글리코릭스4 및 폐 상피 글리코릭스5,및 결합 조직(연골6)과같은 조직에서 구조적 요소로서 중요한 역할을 수행한다.
GAG 다당류 체인의 길이는 생물학적 맥락에 따라 크게 다르며 매우 복잡한 효소 규제 시스템7에의해 동적으로 길어지고, 갈라지고, 수정될 수 있다. 중요한 것은, GAG 폴리머 사슬의 길이는 리간드에 대한 그들의 결합 친화성에 실질적으로 기여하고, 그 후, 그들의 생물학적 기능에8,9. 이러한 이유로, 내인성 GAG의 기능의 결정은 그 크기의 감사를 필요로한다. 불행히도, 단백질과 핵산과는 달리 GAGs를 감지하고 측정하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 기술은 거의 존재하며, 이는 역사적으로 이 다양한 다당류 제품군의 생물학적 역할에 대한 비교적 제한된 조사를 초래했습니다.
이 문서에서는 대부분의 생물학적 조직에서 GAG를 분리하고 정화하는 방법에 대해 설명하고, 또한 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE)을 사용하여 분리된 폴리머의 길이를 공정한 수준의 특이성을 평가하는 방법을 설명합니다. 다른, 매우 복잡 한 (그리고 종종 질량 분광계 기반) 글리코믹 접근 과는 달리, 이 방법은 표준 실험실 장비 및 기술을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 따라서 이러한 실용적인 접근법은 원주민 GAGs의 생물학적 역할과 문맥적으로 중요한 리간드와의 상호 작용을 결정하는 조사관의 능력을 확장할 수 있습니다.
Protocol
이 프로토콜에서 분석된 모든 생물학적 샘플은 콜로라도 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 마우스로부터 수득되었습니다. 1. 헤파란 황산염 고립 조직 샘플의 탈지참고: 탈지화는 지방이 풍부한 조직을 위한 선택 사항입니다. 메탄올과 디클로로메탄의 1:1 혼합물을 만듭니다. 샘플 당 약 500 μL을 준비; 조직의 큰 조?…
Representative Results
알시안 블루는 황산 GAGs 10을염색하는 데 사용된다; 이 신호는 후속 실버 얼룩(11)을사용하여 증폭된다. 도 1은 은 염색 개발 프로세스의 시각적 데모를 제공합니다. 입증된 바와 같이, 발전에이전트가 폴리아크릴아미드 젤을 관통함에 따라 전기포고증에 의해 분리된 GAGs를 나타내는 알시안 청색 신호가 증폭된다. 일반적으로 개발 과정은 ?…
Discussion
GAGs는 다양한 생물학적 프로세스에서 중심적인 역할을 합니다. 황화 GAGs (HS 및 CS와 같은)의 주요 기능 중 하나는 다운스트림 신호 기능을 변경할 수있는 리간드와 상호 작용하고 결합하는 것입니다. 개그 결합 친화성의 중요한 결정요인은 GAG 폴리머 체인 8,9,14의길이이다. 이러한 이유로, 연구원은 합리적인 정밀하게 관심의 생…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL 및 EPS)에 의해 투자되었다
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
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Citer Cet Article
LaRiviere, W. B., Han, X., Oshima, K., McMurtry, S. A., Linhardt, R. J., Schmidt, E. P. Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining. J. Vis. Exp. (168), e62319, doi:10.3791/62319 (2021).