Detektion av glykosaminoglykaner av polyakrylamidgelelektrofores och silverfärgning
Summary
Denna rapport beskriver tekniker för att isolera och rena sulferade glykosaminoglykaner (GAGs) från biologiska prover och en polyakrylamid gel elektrofores strategi för att approximera deras storlek. GAGs bidrar till vävnadsstruktur och påverkar signalprocesser via elektrostatisk interaktion med proteiner. GAG polymer längd bidrar till deras bindande affinitet för konjak ligands.
Abstract
Sulferade glykosaminoglykaner (GAGs) såsom heparansulfat (HS) och kondroitinsulfat (CS) är allestädes närvarande i levande organismer och spelar en avgörande roll i en mängd grundläggande biologiska strukturer och processer. Som polymerer finns GAGs som en polydisperseblandning som innehåller polysackaridkedjor som kan variera från 4000 Da till väl över 40 000 Da. Inom dessa kedjor finns domäner av sulfation, vilket ger ett mönster av negativ laddning som underlättar interaktion med positivt laddade rester av konjakprotein ligands. Sulferade områden av gags måste vara tillräckligt långa för att möjliggöra dessa elektrostatiska interaktioner. För att förstå gags funktion i biologiska vävnader måste prövaren kunna isolera, rena och mäta storleken på GAGs. Denna rapport beskriver en praktisk och mångsidig polyakrylamid gel elektrofores-baserade teknik som kan utnyttjas för att lösa relativt små skillnader i storlek mellan GAGs isolerade från en mängd olika biologiska vävnadstyper.
Introduction
Glykosaminoglykaner (GAGs) är en mångfaldig familj linjära polysackarider som är ett allestädes närvarande element i levande organismer och bidrar till många grundläggande fysiologiska processer1. GAGs såsom heparan sulfat (HS) och kondroitin sulfat (CS) kan sulferas i distinkta positioner längs polysackaridkedjan, vilket ger geografiska domäner av negativ laddning. Dessa GAGs, när de är bundna till cell-ytproteiner som kallas proteoglykaner, projicerar i det extracellulära utrymmet och binder till konjak ligands, vilket möjliggör reglering av både cis- (ligand fäst vid samma cell) och trans- (ligand fäst vid angränsande cell) signaleringsprocesser2. Vidare utför GAGs också kritiska roller som strukturella element i vävnader som glomerulärtkällarmembran 3, vaskulär endotel glycocalyx4 och pulmonell epitelial glykocalyx5, och i bindväv sådan brosk6.
Längden på GAG-polysackaridkedjor varierar avsevärt beroende på dess biologiska sammanhang och kan dynamiskt förlängas, klyvas och modifieras av ett mycket komplext enzymatiskt regleringssystem7. Viktigt är att längden på GAG-polymerkedjor bidrar väsentligt till deras bindande affinitet för ligands och därefter till deras biologiska funktion8,9. Av denna anledning kräver bestämning av funktionen hos en endogen GAG uppskattning av dess storlek. Till skillnad från proteiner och nukleinsyror finns det tyvärr mycket få lättillgängliga tekniker för att upptäcka och mäta god redovisningssed, vilket historiskt sett har resulterat i en relativt begränsad undersökning av de biologiska rollerna för denna mångskiftande polysackaridfamilj.
Denna artikel beskriver hur man isolerar och renar GAGs från de flesta biologiska vävnader, och beskriver också hur man använder polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) för att utvärdera längden på de isolerade polymererna med en rimlig grad av specificitet. I motsats till andra, mycket komplexa (och ofta masspektrometribaserade) glykemiska metoder kan denna metod användas med hjälp av standard laboratorieutrustning och tekniker. Detta praktiska tillvägagångssätt kan därför utöka utredarnas förmåga att bestämma den biologiska rollen för inhemska god redovisningssed och deras interaktion med kontextuellt viktiga ligands.
Protocol
Representative Results
Discussion
God redovisningssed spelar en central roll i många olika biologiska processer. En av de viktigaste funktionerna hos sulferade GAGs (som HS och CS) är att interagera med och binda till ligands, vilket kan ändra nedströms signalfunktioner. En viktig determinant för GAG-bindande affinitet till konjak ligands är längden på GAG-polymerkedjan 8,9,14. Därför är det viktigt att forskare med rimlig precision kan definiera stor…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansierades av F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL och EPS)
Materials
| Accuspin Micro17 benchtop microcentrifuge | thermoFisher Scientific | 13-100-675 | Any benchtop microcentrifuge/rotor combination capable of 14000 xG is appropriate |
| Acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP170-100 | Electrophoresis grade |
| Actinase E | Sigma Aldrich | P5147 | Protease mix from S. griseus |
| Alcian Blue 8GX (solid) | thermoFisher Scientific | AC400460100 | |
| Ammonium acetate (solid) | thermoFisher Scientific | A639-500 | Molecular biology grade |
| Ammonium hydroxide (liquid) | thermoFisher Scientific | A669S-500 | certified ACS |
| Ammonium persulfate (solid) | thermoFisher Scientific | BP179-25 | electrophoresis grade |
| Barnstead GenPure Pro Water Purification System | ThermoFisher Scientific | 10-451-217PKG | Any water deionizing/ purification system is an acceptable substitute |
| Boric acid (solid) | thermoFisher Scientific | A73-500 | Molecular biology grade |
| Bromphenol blue (solid) | thermoFisher Scientific | B392-5 | |
| Calcium acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | 18-609-432 | Molecular biology grade |
| Calcium chloride (solid) | ThermoFisher Scientific | AC349610250 | Molecular biology grade |
| CHAPS detergent (3-((3-cholamidopropyl) dimethylammonio)-1-propanesulfonate) | ThermoFisher Scientific | 28299 | |
| Chondroitinase ABC | Sigma Aldrich | C3667 | |
| Criterion empty cassette for PAGE (1.0mm thick, 12+2 wells) | Bio-Rad | 3459901 | Any 1.0mm thick PAGE casting cassette system will suffice |
| Criterion PAGE Cell system (cell and power supply) | Bio-Rad | 1656019 | any comparable vertical gel PAGE system will work) |
| Dichloromethane (liquid) | thermoFisher Scientific | AC610931000 | certified ACS |
| EDTA disodium salt (solid) | thermoFisher Scientific | 02-002-786 | Molecular biology grade |
| Glacial acetic acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A35-500 | Certified ACS |
| Glycine (solid) | thermoFisher Scientific | G48-500 | Electrophoresis grade |
| Heparanase I/III | Sigma Aldrich | H3917 | From Flavobacterium heparinum |
| Heparin derived decasaccharide (dp10) | galen scientific | HO10 | |
| Heparin derived hexasaccharde (dp6) | Galen scientific | HO06 | |
| Heparin derived oligosaccharide (dp20) | galen scientific | HO20 | |
| Hydrochloric acid (liquid) | thermoFisher Scientific | A466-250 | |
| Lyophilizer | Labconco | 7752020 | Any lyophilizer that can achieve -40C and 0.135 Torr will work; can also be replaced with rotational vacuum concentrator |
| Methanol (liquid) | thermoFisher Scientific | A412-500 | Certified ACS |
| Molecular Imager Gel Doc XR System | Bio-Rad | 170-8170 | Any comparable gel imaging system is an acceptable substitute |
| N,N'-methylene-bis-acrylamide (solid) | thermoFisher Scientific | BP171-25 | Electrophoresis grade |
| Phenol red (solid) | thermoFisher Scientific | P74-10 | Free acid |
| Q Mini H Ion Exchange Column | Vivapure | VS-IX01QH24 | Ion exchange column must have minimum loading volume of 0.4mL, working pH of 2-12, and selectivity for ionic groups with pKa of 11 |
| Silver nitrate (solid) | thermoFisher Scientific | S181-25 | certified ACS |
| Sodium Acetate (solid) | ThermoFisher Scientific | S210-500 | Molecular biology grade |
| Sodium chloride (solid) | thermoFisher Scientific | S271-500 | Molecular biology grade |
| Sodium hydroxide (solid) | thermoFisher Scientific | S392-212 | |
| Sucrose (solid) | thermoFisher Scientific | BP220-1 | Molecular biology grade |
| TEMED (N,N,N',N'-tetramethylenediamine) | thermoFisher Scientific | BP150-20 | Electrophoresis grade |
| Tris base (solid) | thermoFisher Scientific | BP152-500 | Molecular biology grade |
| Ultra Centrifugal filters, 0.5mL, 3000 Da molecular weight cutoff | Amicon | UFC500324 | Larger volume filter units may be used, depending on sample size. |
| Urea (solid) | ThermoFisher Scientific | 29700 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 22820001 | Any rotational vacuum concentrator will work; can be replaced with lyophilizer |
| Vacuum filter unit, single use, 0.22uM pore PES, 500mL volume | thermoFisher Scientific | 569-0020 | Alternative volumes and filter materials acceptable |
References
- LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate. Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).
- Haeger, S. M., Yang, Y., Schmidt, E. P. Heparan sulfate in the developing, healthy, and injured lung. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (1), 5-11 (2016).
- Morita, H., Yoshimura, A., Kimata, K. The role of heparan sulfate in the glomerular basement membrane. Kidney International. 73 (3), 247-248 (2008).
- Schmidt, E. P., et al. The pulmonary endothelial glycocalyx regulates neutrophil adhesion and lung injury during experimental sepsis. Nature Medicine. 18 (8), 1217-1223 (2012).
- Haeger, S. M., et al. Epithelial heparan sulfate contributes to alveolar barrier function and is shed during lung injury. American Journal of Respiratry Cell and Molecular Biology. 59 (3), 363-374 (2018).
- Mankin, H. J., Lippiello, L. The glycosaminoglycans of normal and arthritic cartilage. Journal of Clinical Investigation. 50 (8), 1712-1719 (1971).
- Annaval, T., et al. Heparan sulfate proteoglycans biosynthesis and post synthesis mechanisms combine few enzymes and few core proteins to generate extensive structural and functional diversity. Molecules. 25 (18), (2020).
- Zhang, F., et al. Comparison of the interactions of different growth factors and glycosaminoglycans. Molecules. 24 (18), (2019).
- Pempe, E. H., Xu, Y., Gopalakrishnan, S., Liu, J., Harris, E. N. Probing structural selectivity of synthetic heparin binding to Stabilin protein receptors. Journal of Biological Chemistry. 287 (25), 20774-20783 (2012).
- Cowman, M. K., et al. Polyacrylamide-gel electrophoresis and Alcian Blue staining of sulphated glycosaminoglycan oligosaccharides. Biochemical Journal. 221 (3), 707-716 (1984).
- Møller, H. J., Poulsen, J. H. Improved method for silver staining of glycoproteins in thin sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gels. Analytical Biochemistry. 226 (2), 371-374 (1995).
- Min, H., Cowman, M. K. Combined alcian blue and silver staining of glycosaminoglycans in polyacrylamide gels: Application to electrophoretic analysis of molecular weight distribution. Analytical Biochemistry. 155 (2), 275-285 (1986).
- Jay, G. D., Culp, D. J., Jahnke, M. R. Silver staining of extensively glycosylated proteins on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels: Enhancement by carbohydrate-binding dyes. Analytical Biochemistry. 185 (2), 324-330 (1990).
- Abraham, E., et al. Liposomal prostaglandin E1 (TLC C-53) in acute respiratory distress syndrome: a controlled, randomized, double-blind, multicenter clinical trial. TLC C-53 ARDS Study Group. Critical Care Medicine. 27 (8), 1478-1485 (1999).
- Pervin, A., al-Hakim, A., Linhardt, R. J. Separation of glycosaminoglycan-derived oligosaccharides by capillary electrophoresis using reverse polarity. Analytical Biochemistry. 221 (1), 182-188 (1994).
- Wang, Z., Zhang, F., Dordick, J. S., Linhardt, R. J. Molecular mass characterization of glycosaminoglycans with different degrees of sulfation in bioengineered heparin process by size exclusion chromatography. Current Analytical Chemistry. 8 (4), 506-511 (2012).
- Pepi, L. E., Sanderson, P., Stickney, M., Amster, I. J. Developments in mass spectrometry for glycosaminoglycan analysis: A review. Molecular and Cellular Proteomics. , 100025 (2021).
- Whiteman, P. The quantitative measurement of Alcian Blue-glycosaminoglycan complexes. Biochemical Journal. 131 (2), 343-350 (1973).
- Yuan, H., et al. Molecular mass dependence of hyaluronan detection by sandwich ELISA-like assay and membrane blotting using biotinylated hyaluronan binding protein. Glycobiology. 23 (11), 1270-1280 (2013).
