从小鼠肩胛间棕色脂肪组织中分离棕色脂肪细胞以进行基因和蛋白质表达分析
Summary
本研究描述了一种分离小鼠棕色脂肪细胞用于基因和蛋白质表达分析的新方法。
Abstract
棕色脂肪组织（BAT）负责哺乳动物的非颤抖产热，棕色脂肪细胞（BA）是BAT的功能单位。BAs含有多房脂滴和丰富的线粒体，它们表达解偶联蛋白1（UCP1）。BA根据其起源分为两种亚型：胚胎衍生的经典BA（cBA）和白色脂肪细胞衍生的BA。由于其密度相对较低，传统的离心方法无法从BAT中分离出来。本研究开发了一种从小鼠中分离BA进行基因和蛋白质表达分析的新方法。在该协议中，用胶原酶和分散酶溶液消化成年小鼠的肩胛间BAT，并用6%碘沙醇溶液富集解离的BA。然后用Trizol试剂裂解分离的BA，以同时分离RNA、DNA和蛋白质。RNA分离后，裂解物的有机相用于蛋白质提取。我们的数据显示，6%碘沙醇溶液有效地富集了BAs，而不会干扰后续的基因和蛋白质表达研究。血小板衍生生长因子（PDGF）是一种调节间充质细胞生长和增殖的生长因子。与棕色脂肪组织相比，分离的BAs具有显着更高的 Pdgfa表达。总之，这种新方法为在单细胞类型水平上研究棕色脂肪细胞的生物学提供了一个平台。
Introduction
小鼠和人类都有两种类型的脂肪组织：白色脂肪组织（WAT）和棕色脂肪组织（BAT）1。WAT以甘油三酯的形式将能量储存在白色脂肪细胞中，BAT的棕色脂肪细胞（BAs）以热量的形式耗散化学能2。根据其发育起源，BA进一步分为胚胎发育过程中形成的经典BA（cBA）和白色脂肪细胞衍生的BA（米色/白细胞，在应激条件下从白色脂肪细胞转化而来）3。BA是多房的，表达产热蛋白解偶联蛋白1（UCP1）4。肩胛间蝙蝠（iBAT）储存库是小型哺乳动物5的主要cBAs储存库之一，而米色细胞分散在WAT6内。
由于其耗散能量的性质，BAs作为减少肥胖的治疗靶点而受到广泛关注7。为了利用BA治疗肥胖症，必须了解控制BA功能，存活和募集的分子机制。脂肪组织包括BAT和WAT是异质的。除脂肪细胞外，脂肪组织还含有许多其他细胞类型，例如内皮细胞，间充质干细胞和巨噬细胞8。尽管存在特异性消耗小鼠BA候选基因的遗传工具，例如UCP1：：Cre系9，但从BAT或WAT纯化BA的技术有限，因此难以在单细胞类型水平上研究BA。此外，如果没有获得纯BA，BA和非BA之间的关系将无法明确界定。例如，血小板衍生生长因子受体α（PDGFRα）已被用作未分化间充质细胞的标志物，并在BAT的内皮和间质细胞中表达。在冷应激的BAT中，PDGFRα阳性祖细胞产生新的BAs10。PDGFRα被其配体PDGF激活，PDGF是一种调节间充质细胞生长和增殖的生长因子11;然而，尚不清楚BAs是否通过分泌PDGF影响PDGFRα阳性祖细胞的行为。
最近，基于荧光激活细胞分选（FACS）的BAs分离方案已经发布12。在该方案中，使用3%牛血清白蛋白（BSA）溶液将BAs与非BAs分离，并通过FACS进一步纯化富集的BAs。该协议的应用受到FACS过程要求的限制，该过程依赖于设备和FACS操作经验。在这项研究中，开发了一种将BA与BAT分离的新协议。通过该方案分离的BA可以直接用于基因和蛋白质表达研究。此外，这项研究的数据表明，BA是PDGF的主要资源。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究开发了一种分离BAs用于基因和蛋白质表达分析的新方法。
在已发布的BAs分离方案中，使用3%BSA溶液来富集BAs12。然而，通过该已发表的方案获得的富集BA不能直接用于蛋白质表达分析。这是因为BAs溶液中存在的浓缩BSA会干扰后续蛋白质提取。当富集在3%BSA溶液中的BA用Trizol试剂处理时，会形成粘性蛋白质聚集体，其中大部分不溶于GTPC蛋白质提取过程。此…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin得到了美国国立卫生研究院HL138454-01和共济会医学研究所基金的支持。
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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