Isolierung von braunen Adipozyten aus murinem interskapulärem braunem Fettgewebe für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse
Summary
Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Isolierung von murinen braunen Adipozyten für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse.
Abstract
Braunes Fettgewebe (BAT) ist für die nicht zitternde Thermogenese bei Säugetieren verantwortlich, und braune Adipozyten (BAs) sind die funktionellen Einheiten von BAT. BAs enthalten sowohl multilokuläre Lipidtröpfchen als auch reichlich Mitochondrien und exprimieren das Entkopplungsprotein 1 (UCP1). BAs werden basierend auf ihrer Herkunft in zwei Subtypen eingeteilt: embryonale klassische BAs (cBAs) und weiße Adipozyten abgeleitete BAs. Aufgrund ihrer relativ geringen Dichte können BAs mit herkömmlichen Zentrifugationsmethoden nicht aus BVT isoliert werden. In dieser Studie wurde eine neue Methode entwickelt, um BAs aus Mäusen für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse zu isolieren. In diesem Protokoll wurde interskapuläre BAT von erwachsenen Mäusen mit Kollagenase- und Dispase-Lösung verdaut, und die dissoziierten BAs wurden mit 6% iger Jodixanollösung angereichert. Isolierte BAs wurden dann mit Trizol-Reagenz zur gleichzeitigen Isolierung von RNA, DNA und Protein lysiert. Nach der RNA-Isolierung wurde die organische Phase des Lysats für die Proteinextraktion verwendet. Unsere Daten zeigten, dass 6% Jodixanollösung BAs effizient anreicherte, ohne Folgestudien zur Gen- und Proteinexpression zu stören. Platelet-derived growth factor (PDGF) ist ein Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert. Im Vergleich zum braunen Fettgewebe hatten isolierte BAs eine signifikant höhere Expression von Pdgfa. Zusammenfassend bietet diese neue Methode eine Plattform, um die Biologie brauner Adipozyten auf Einzelzelltypebene zu untersuchen.
Introduction
Sowohl Mäuse als auch Menschen haben zwei Arten von Fettgewebe: weißes Fettgewebe (WAT) und braunes Fettgewebe (BAT)1. WAT speichert Energie in Form von Triglyceriden in weißen Adipozyten, und die braunen Adipozyten (BAs) von BAT leiten chemische Energie als Wärme2 ab. Basierend auf ihrem Entwicklungsursprung werden BAs weiter kategorisiert in klassische BAs (cBAs), die während der Embryonalentwicklung entstanden sind, und aus weißen Adipozyten gewonnene BAs (beige/brite Zellen, die unter Stressbedingungen aus weißen Adipozyten umgewandelt werden)3. BAs sind multilokulär und exprimieren das thermogene Proteinentkopplungsprotein 1 (UCP1)4. Das interskapuläre BAT-Depot (iBAT) ist eines der primären cBAs-Depots bei kleinen Säugetieren5, während beige Zellen innerhalb von WAT6 dispergiert sind.
Aufgrund ihrer Art der Energieableitung haben BAs als therapeutisches Ziel zur Verringerung von Fettleibigkeit viel Aufmerksamkeit erhalten7. Um BAs zur Behandlung von Fettleibigkeit zu nutzen, ist es wichtig, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Funktion, das Überleben und die Rekrutierung von BAs steuern. Fettgewebe einschließlich BAT und WAT sind heterogen. Abgesehen von Adipozyten enthält Fettgewebe viele andere Zelltypen wie Endothelzellen, mesenchymale Stammzellen und Makrophagen8. Obwohl genetische Werkzeuge zur spezifischen Depletion von Kandidatengenen in Mäuse-BAs verfügbar sind, wie UCP1::Cre Linie9, sind Techniken zur Reinigung von BAs von BAT oder WAT begrenzt, was es schwierig macht, BAs auf Einzelzellebene zu untersuchen. Darüber hinaus wird ohne reine BAs die Beziehung zwischen BAs und Nicht-BAs nicht klar abgegrenzt. Zum Beispiel wurde der von Blutplättchen abgeleitete Wachstumsfaktorrezeptor alpha (PDGFRα) als Marker für undifferenzierte mesenchymale Zellen verwendet und wird in den endothelialen und interstitiellen Zellen von BAT exprimiert. In kalt gestressten BAT entstehen durch PDGFRα-positive Vorläuferzellen neue BAs10. PDGFRα wird durch seinen Liganden PDGF aktiviert, einen Wachstumsfaktor, der das Wachstum und die Proliferation von mesenchymalen Zellen reguliert11; Es ist jedoch unklar, ob BAs das Verhalten von PDGFRα-positiven Vorläuferzellen beeinflussen, indem sie PDGF sezernieren.
Vor kurzem wurde ein BAs-Isolationsprotokoll veröffentlicht, das auf Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)12 basiert. In diesem Protokoll wurde 3% ige Rinderserumalbumin (BSA) -Lösung verwendet, um BAs von Nicht-BAs zu trennen, und die angereicherten BAs wurden durch FACS weiter gereinigt. Die Anwendung dieses Protokolls ist durch die Anforderung des FACS-Prozesses begrenzt, der sowohl auf Geräten als auch auf FACS-Betriebserfahrungen beruht. In dieser Studie wurde ein neues Protokoll zur Isolierung von BAs aus BAT entwickelt. Die durch dieses Protokoll isolierten BAs können direkt für Gen- und Proteinexpressionsstudien verwendet werden. Darüber hinaus deuten Daten aus dieser Studie darauf hin, dass BAs eine wichtige PDGF-Ressource sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dieser Studie wurde eine neue Methode zur Isolierung von BAs für die Gen- und Proteinexpressionsanalyse entwickelt.
In einem veröffentlichten BAs-Isolationsprotokoll wurde eine 3%ige BSA-Lösung zur Anreicherung von BAs12 verwendet. Dennoch konnten die angereicherten BAs, die durch dieses veröffentlichte Protokoll erzielt wurden, nicht direkt für die Proteinexpressionsanalyse verwendet werden. Dies liegt daran, dass das in der BAs-Lösung vorhandene konzentrierte…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin wurde von den National Institutes of Health HL138454-01 und dem Masonic Medical Research Institute unterstützt.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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