遺伝子およびタンパク質発現解析のためのマウス肩甲間褐色脂肪組織からの褐色脂肪細胞の単離(英語)
Summary
この研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウス褐色脂肪細胞を単離する新しい方法について説明します。
Abstract
褐色脂肪組織(BAT)は哺乳類の非震え熱発生に関与しており、褐色脂肪細胞(BA)はBATの機能単位です。BAは多房性脂肪滴と豊富なミトコンドリアの両方を含み、脱共役タンパク質1(UCP1)を発現します。BAは、その起源に基づいて、胚由来の古典的BA(cBA)と白色脂肪細胞由来のBAの2つのサブタイプに分類されます。BAは密度が比較的低いため、従来の遠心分離法ではBATから分離できません。本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためにマウスからBAを単離する新しい方法を開発しました。このプロトコルでは、成体マウスの肩甲骨間BATをコラゲナーゼおよびディスパーゼ溶液で消化し、解離したBAを6%ヨージキサノール溶液で濃縮した。次に、単離したBAをTrizol試薬で溶解し、RNA、DNA、およびタンパク質を同時に単離しました。RNA単離後、ライセートの有機相をタンパク質抽出に使用した。私たちのデータは、6%ヨージキサノール溶液がフォローアップ遺伝子およびタンパク質発現研究を妨げることなくBAを効率的に濃縮することを示しました。血小板由来成長因子(PDGF)は、間葉系細胞の増殖および増殖を調節する成長因子である。褐色脂肪組織と比較して、単離されたBAは Pdgfaの発現が有意に高かった。要約すると、この新しい方法は、褐色脂肪細胞の生物学を単一の細胞型レベルで研究するためのプラットフォームを提供します。
Introduction
マウスとヒトの両方に、白色脂肪組織(WAT)と褐色脂肪組織(BAT)の2種類の脂肪組織があります1。WATは白色脂肪細胞に中性脂肪の形でエネルギーを蓄え、BATの褐色脂肪細胞(BA)は化学エネルギーを熱2として放散します。BAは、その発生起源に基づいて、胚発生中に形成される古典的なBA(cBA)と、ストレス条件下で白色脂肪細胞から変換された白色脂肪細胞由来のBA(ベージュ/ブライト細胞)にさらに分類されます3。BAは多房性であり、熱発生タンパク質脱共役タンパク質1(UCP1)4を発現します。肩甲骨間BAT(iBAT)デポーは、小型哺乳類の主要なcBAデポの1つです5が、ベージュ色の細胞はWAT6内に分散しています。
エネルギーを散逸させる性質上、BAは肥満を減らすための治療標的として多くの注目を集めています7。肥満の治療を目的としてBAを利用するためには、BAの機能、生存、および動員を制御する分子メカニズムを理解することが不可欠です。BATおよびWATを含む脂肪組織は不均一である。脂肪細胞を除いて、脂肪組織には内皮細胞、間葉系幹細胞、マクロファージなど、他の多くの細胞タイプが含まれています8。UCP1::Creライン9など、マウスBAの候補遺伝子を特異的に枯渇させる遺伝的ツールが利用可能であるが、BATまたはWATからBAを精製する技術は限られており、単一細胞レベルでBAを研究することは困難である。さらに、純粋なBAを取得しないと、BAと非BAの関係が明確に描写されません。例えば、血小板由来成長因子受容体α(PDGFRα)は、未分化間葉系細胞のマーカーとして使用されており、BATの内皮細胞や間質細胞で発現しています。低温ストレスBATでは、PDGFRα陽性前駆細胞が新しいBA10を生じさせる。PDGFRαは、間葉系細胞の成長および増殖を調節する成長因子であるリガンドPDGFによって活性化される11;しかし、BAがPDGFを分泌することによってPDGFRα陽性前駆細胞の挙動に影響を与えるかどうかは不明である。
最近、蛍光活性化セルソーティング(FACS)12に基づくBAs分離プロトコルが公開されました。このプロトコルでは、3%ウシ血清アルブミン(BSA)溶液を使用してBAを非BAから分離し、濃縮BAをFACSでさらに精製しました。このプロトコルの適用は、機器とFACSの両方の操作経験に依存するFACSプロセスの要件によって制限されます。本研究では、BATからBAを分離するための新しいプロトコルが開発されました。このプロトコルによって単離されたBAは、遺伝子およびタンパク質発現研究に直接使用できます。さらに、この研究のデータは、BAが主要なPDGFリソースであることを示唆しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、遺伝子およびタンパク質発現解析のためのBAを単離する新しい方法を開発しました。
公開されているBA分離プロトコルでは、3%BSA溶液を使用してBA12を濃縮しました。それにもかかわらず、この公開されたプロトコルによって達成された濃縮BAは、タンパク質発現分析に直接使用することはできませんでした。これは、BAs溶液に存在する濃縮BS…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Linは、国立衛生研究所HL138454-01とフリーメーソン医学研究所の資金によって支援されました。
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
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