Выделение коричневых адипоцитов из мышиной межлопаточной коричневой жировой ткани для анализа экспрессии генов и белков
Summary
Это исследование описывает новый метод выделения мышиных коричневых адипоцитов для анализа экспрессии генов и белков.
Abstract
Коричневая жировая ткань (BAT) отвечает за недрожащий термогенез у млекопитающих, а коричневые адипоциты (BA) являются функциональными единицами BAT. БА содержат как мультилокулярные липидные капли, так и обильные митохондрии, и они экспрессируют разъединяющий белок 1 (UCP1). БА подразделяются на два подтипа в зависимости от их происхождения: классические БА, полученные из эмбриона (цБА), и БА, полученные из белых адипоцитов. Из-за их относительно низкой плотности БА не могут быть выделены из НИМ традиционным методом центрифугирования. В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА от мышей для анализа экспрессии генов и белков. В этом протоколе межлопаточный BAT у взрослых мышей переваривали раствором коллагеназы и диспазы, а диссоциированные БА обогащали 6% раствором йодиксанола. Затем выделенные БА лизировали реагентом тризол для одновременного выделения РНК, ДНК и белка. После выделения РНК органическая фаза лизата использовалась для экстракции белка. Наши данные показали, что 6% раствор йодиксанола эффективно обогащал БА, не вмешиваясь в последующие исследования экспрессии генов и белков. Тромбоцитарный фактор роста (PDGF) является фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток. По сравнению с коричневой жировой тканью, изолированные БА имели значительно более высокую экспрессию Pdgfa. Таким образом, этот новый метод обеспечивает платформу для изучения биологии коричневых адипоцитов на уровне одного клеточного типа.
Introduction
Как мыши, так и люди имеют два типа жировых тканей: белая жировая ткань (WAT) и коричневая жировая ткань (BAT)1. WAT хранит энергию в виде триглицеридов в белых адипоцитах, а коричневые адипоциты (BA) BAT рассеивают химическую энергию в виде тепла2. Основываясь на своем происхождении развития, БА далее классифицируются на классические БА (цБА), которые образовались во время развития эмбриона, и белые адипоциты, полученные из БА (бежевые / бритовые клетки, преобразованные из белых адипоцитов в условиях стресса)3. БА являются многолокулярными и экспрессируют термогенный белок, разъединяющий белок 1 (UCP1)4. Депо межлопастных BAT (iBAT) является одним из основных депо cBA у мелких млекопитающих5, тогда как бежевые клетки диспергированы внутри WAT6.
Из-за своей природы рассеивания энергии, БА получили большое внимание в качестве терапевтической мишени для снижения ожирения7. Чтобы использовать БА для лечения ожирения, важно понимать молекулярные механизмы, которые контролируют функцию, выживание и рекрутирование БА. Жировые ткани, включая BAT и WAT, неоднородны. За исключением адипоцитов, жировые ткани содержат много других типов клеток, таких как эндотелиальные клетки, мезенхимальные стволовые клетки и макрофаги8. Хотя доступны генетические инструменты для конкретного истощения генов-кандидатов у мышей, такие как UCP1: Cre line9, методы очистки БА от BAT или WAT ограничены, что затрудняет изучение БА на уровне одноклеточного типа. Кроме того, без получения чистых БА отношения между БА и не-БА не будут четко очерчены. Например, рецептор фактора роста тромбоцитов альфа (PDGFRα) был использован в качестве маркера для недифференцированных мезенхимальных клеток, и он экспрессируется в эндотелиальных и интерстициальных клетках BAT. При холодном стрессе BAT PDGFRα положительные клетки-предшественники дают начало новым BA10. PDGFRα активируется его лигандом PDGF, фактором роста, который регулирует рост и пролиферацию мезенхимальных клеток11; однако неясно, влияют ли БА на поведение PDGFRα-положительных клеток-предшественников путем секреции PDGF.
Недавно был опубликован протокол изоляции БА, который основан на флуоресцентно-активированной сортировке клеток (FACS)12. В этом протоколе 3% раствор бычьего сывороточного альбумина (BSA) использовался для отделения БА от не-БА, а обогащенные БА дополнительно очищались FACS. Применение этого протокола ограничено требованием процесса СУИМ, который опирается как на оборудование, так и на опыт работы СУИМ. В этом исследовании был разработан новый протокол изоляции БА от НИМ. БА, выделенные этим протоколом, могут быть непосредственно использованы для исследований экспрессии генов и белков. Кроме того, данные этого исследования свидетельствуют о том, что БА являются основным ресурсом PDGF.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании был разработан новый метод выделения БА для анализа экспрессии генов и белков.
В опубликованном протоколе изоляции БА для обогащения БА12 использовался 3% раствор BSA. Тем не менее, обогащенные БА, достигнутые этим опубликованным протоколом…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Z. Lin был поддержан фондами Национального института здравоохранения HL138454-01 и Масонского медицинского научно-исследовательского института.
Materials
| Antibodies | |||
| Antigen | Company | Catalog | |
| PPARγ | LSBio | Ls-C368478 | |
| PDGFRa | Santa Cruz | sc-398206 | |
| UCP1 | R&D system | IC6158P | |
| Chemical and solutions | |||
| Collagenase, Type II | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | |
| 1-Bromo-3-chloropropane | Sigma-Aldrich | B62404 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Goldbio | A-421-10 | |
| Calcium chloride | Bio Basic | CT1330 | |
| Chloroform | IBI Scientific | IB05040 | |
| Dispase II, protease | Sigma-Aldrich | D5693 | |
| EDTA | Bio Basic | EB0107 | |
| Ethanol | IBI Scientific | IB15724 | |
| LiQuant Universal Green qPCR Master Mix | LifeSct | LS01131905Y | |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Boston BioProducts | P-855 | |
| OneScrip Plus cDNA Synthesis SuperMix | ABM | G454 | |
| OptiPrep (Iodixanol) | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| PBS (10x) | Caisson Labs | PBL07 | |
| PBS (1x) | Caisson Labs | PBL06 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Potassium Chloride | Boston BioProducts | P-1435 | |
| SimplyBlue safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 75746 | |
| Trizol reagent | Life technoologies | 15596018 | |
| Primers | |||
| Gene name (Species) | Forward | Reverse | |
| Pdgfra (Mouse) | CTCAGCTGTCTCCTCACAgG | CAACGCATCTCAGAGAAAAGG | |
| Pdgfa (Mouse) | TGTGCCCATTCGCAGGAAGAG | TTGGCCACCTTGACACTGCG | |
| 36B4(Mouse) | TGCTGAACATCTCCCCCTTCTC | TCTCCACAGACAATGCCAGGAC | |
| Ucp1 | ACTGCCACACCTCCAGTCATT | CTTTGCCTCACTCAGGATTGG | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Application | |
| Keyence BZ-X700 | Keyence | Imaging brown adipocytes | |
| Magnetic stirrer | VWR | Dissociate BAT | |
| QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System | Applied Biosystem | Quantitative PCR | |
| The Odyssey Fc Imaging system | LI-COR | Western blot immaging | |
References
- Zwick, R. K., Guerrero-Juarez, C. F., Horsley, V., Plikus, M. V. Anatomical, physiological, and functional diversity of adipose tissue. Cell Metabolism. 27, 68-83 (2018).
- Symonds, M. E. Brown adipose tissue growth and development. Scientifica. 2013, 305763 (2013).
- Giralt, M., Villarroya, F. White, brown, beige/brite: Different adipose cells for different functions. Endocrinology. 154, 2992-3000 (2013).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids. 73, 9-15 (2005).
- Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150, 366-376 (2012).
- Cypess, A. M., Kahn, C. R. Brown fat as a therapy for obesity and diabetes. Current Opinion in Endocrinology, Diabetes and Obesity. 17, 143-149 (2010).
- Schoettl, T., Fischer, I. P., Ussar, S. Heterogeneity of adipose tissue in development and metabolic function. Journal of Experimental Biology. 221, (2018).
- Kong, X., et al. IRF4 is a key thermogenic transcriptional partner of PGC-1α. Cell. 158, 69-83 (2014).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Konkar, A. A., Granneman, J. G. Cellular origins of cold-induced brown adipocytes in adult mice. The FASEB Journal. 29, 286-299 (2015).
- Kim, W. -. S., Park, H. -. S., Sung, J. -. H. The pivotal role of PDGF and its receptor isoforms in adipose-derived stem cells. Histology and Histopathology. 30 (7), 793-799 (2015).
- Hagberg, C. E. Flow cytometry of mouse and human adipocytes for the analysis of browning and cellular heterogeneity. Cell Report. 24, 2746-2756 (2018).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13, 133-140 (2010).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
- Chey, S., Claus, C., Liebert, U. G. Improved method for simultaneous isolation of proteins and nucleic acids. Analytical Biochemistry. 411, 164-166 (2011).
- Ford, T., Graham, J., Rickwood, D. Iodixanol: A nonionic iso-osmotic centrifugation medium for the formation of self-generated gradients. Analytical Biochemistry. 220, 360-366 (1994).
- Kovacovicova, K., Vinciguerra, M. Isolation of senescent cells by iodixanol (OptiPrep) density gradient-based separation. Cell Proliferation. 52, 12674 (2019).
- Lock, M., et al. versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Human Gene Therapy. 21, 1259-1271 (2010).
- Marin, R. D., Crespo-Garcia, S., Wilson, A. M., Sapieha, P. RELi protocol: Optimization for protein extraction from white, brown, and beige adipose tissues. MethodsX. 6, 918-928 (2019).
- Sonna, L. A., Fujita, J., Gaffin, S. L., Lilly, C. M. Invited Review: effects of heat and cold stress on mammalian gene expression. Journal of Applied Physiology. 92, 1725-1742 (2002).
- Gensch, N., Borchardt, T., Schneider, A., Riethmacher, D., Braun, T. Different autonomous myogenic cell populations revealed by ablation of Myf5-expressing cells during mouse embryogenesis. Development. 135, 1597-1604 (2008).
