Gestione avanzata del ritmo cardiaco applicando la fotostimolazione multi-sito optogenetica nei cuori murini
Summary
Questo lavoro riporta un metodo per controllare il ritmo cardiaco di cuori murini intatti di topi transgenici channelrhodopsin-2 (ChR2) utilizzando la fotostimolazione locale con un array di micro-LED e la mappatura ottica simultanea del potenziale della membrana epicardica.
Abstract
Le tachiaritmie ventricolari sono una delle principali cause di mortalità e morbilità in tutto il mondo. La defibrillazione elettrica con scosse elettriche ad alta energia è attualmente l’unico trattamento per la fibrillazione ventricolare pericolosa per la vita. Tuttavia, la defibrillazione può avere effetti collaterali, tra cui dolore intollerabile, danno tissutale e peggioramento della prognosi, indicando una significativa necessità medica per lo sviluppo di strategie di gestione del ritmo cardiaco più delicate. Oltre agli approcci elettrici che riducono l’energia, l’optogenetica cardiaca è stata introdotta come un potente strumento per influenzare l’attività cardiaca utilizzando canali ionici a membrana sensibili alla luce e impulsi luminosi. Nel presente studio, verrà descritto un metodo robusto e valido per la fotostimolazione di successo di cuori murini intatti perfusi di Langendorff basato sulla stimolazione multi-sito applicando un array 3 x 3 di diodi micro emettitori di luce (micro-LED). La mappatura ottica simultanea delle onde di tensione della membrana epicardica consente di studiare gli effetti della stimolazione regionale-specifica e valuta l’attività cardiaca appena indotta direttamente in loco. I risultati ottenuti mostrano che l’efficacia della defibrillazione dipende fortemente dai parametri scelti per la fotostimolazione durante un’aritmia cardiaca. Sarà dimostrato che l’area illuminata del cuore svolge un ruolo cruciale per il successo della terminazione e come è possibile ottenere il controllo mirato dell’attività cardiaca durante l’illuminazione per modificare i modelli di aritmia. In sintesi, questa tecnica offre la possibilità di ottimizzare la manipolazione del meccanismo in loco sulla strada per il controllo del feedback in tempo reale del ritmo cardiaco e, per quanto riguarda la specificità della regione, nuovi approcci nel ridurre il potenziale danno al sistema cardiaco rispetto all’uso di applicazioni di scosse elettriche non specifiche.
Introduction
Le prime indagini sulle dinamiche spazio-temporali durante l’aritmia hanno rivelato che i complessi schemi elettrici durante la fibrillazione cardiaca sono guidati da onde di eccitazione rotanti simili a vortici1. Questa scoperta ha fornito nuove informazioni sui meccanismi alla base delle aritmie, che hanno poi portato allo sviluppo di nuove terapie di terminazione elettrica basate sull’eccitazione multi-sito del miocardio 2,3,4. Tuttavia, i trattamenti che utilizzano la stimolazione del campo elettrico non sono locali e possono innervare tutte le cellule eccitabili circostanti, incluso il tessuto muscolare, causando danni cellulari e tissutali, nonché dolore intollerabile. A differenza delle terapie elettriche, gli approcci optogenetici forniscono una tecnica specifica e protettiva dei tessuti per evocare potenziali d’azione dei cardiomiociti con elevata precisione spaziale e temporale. Pertanto, la stimolazione optogenetica ha il potenziale per un controllo minimamente invasivo dei modelli di attivazione caotica durante la fibrillazione cardiaca.
L’introduzione della canalistica ionica sensibile alla lucerhodopsin-2 (ChR2) nelle cellule eccitabili tramite manipolazione genetica 5,6,7, ha permesso la depolarizzazione del potenziale di membrana delle cellule eccitabili utilizzando la fotostimolazione. Sono state sviluppate diverse applicazioni mediche, tra cui l’attivazione delle reti neuronali, il controllo dell’attività cardiaca, il ripristino della vista e dell’udito, il trattamento delle lesioni del midollo spinale e altre 8,9,10,11,12,13,14. L’applicazione di ChR2 in cardiologia ha un potenziale significativo grazie al suo tempo di risposta al millisecondo15, rendendolo adatto per il controllo mirato della dinamica cardiaca aritmica.
In questo studio, viene mostrata la fotostimolazione multi-sito di cuori intatti di un modello murino transgenico. In sintesi, una linea di topi transgenici alfa-MHC-ChR2 è stata istituita nell’ambito del Settimo Programma Quadro FP7/2007-2013 della Comunità Europea (HEALTH-F2-2009-241526) e gentilmente fornita dal Prof. S. E. Lehnart. In generale, i maschi adulti transgenici C57/B6/J, che esprimono Cre-ricombinasi sotto controllo dell’alfa-MHC, sono stati accoppiati per accoppiarsi con B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm27.1(CAG-COP4*H134R/tdTomato)Hye/J. Poiché la cassetta STOP cardiaca è stata eliminata nella seconda generazione, la prole ha mostrato un’espressione stabile di MHC-ChR2 ed è stata utilizzata per mantenere le colonie fotosensibili cardiache. Tutti gli esperimenti sono stati condotti con topi adulti di entrambi i sessi ad un’età di 36 – 48 settimane. L’illuminazione è ottenuta utilizzando un array di micro-LED 3 x 3, fabbricato come descritto in16,17 tranne per il fatto che l’alloggiamento a base di silicio e le fibre corte di vetro ottico non sono implementati. Il suo primo utilizzo in un’applicazione cardiaca si trova in18. Un array lineare di micro-LED basato su una tecnologia di fabbricazione simile è stato applicato come sonda penetrante per la stimolazione cardiaca19. I micro-LED sono disposti in un array 3 x 3 con un passo di 550 μm, fornendo sia un’elevata risoluzione spaziale che un’elevata potenza radiante su un’area molto piccola. Gli autori dimostrano in questo lavoro una versatile fotostimolazione locale multi-sito che può aprire la strada allo sviluppo di nuovi metodi di terapia anti-aritmica.
Il seguente protocollo sperimentale prevede una perfusione retrograda di Langendorff ex vivo, per la quale l’aorta cannulata funge da ingresso di perfusione. A causa della pressione di perfusione applicata e della contrazione cardiaca, il perfusato scorre attraverso le arterie coronarie, che si diramano dall’aorta. Nel lavoro presentato, il cuore viene perfuso utilizzando una configurazione a pressione costante ottenuta elevando i serbatoi di perfuso a 1 m di altezza, equivalente a 73,2 mmHg, che produce una portata di 2,633 ± 0,583 ml / min. Due tipi di soluzione di Tyrode sono usati come perfufuto durante l’esperimento. La soluzione di Regular Tyrode supporta un ritmo sinusale stabile, mentre la soluzione di Low-K+ Tyrode viene miscelata con Pinacidil per consentire l’induzione dell’aritmia nei cuori murini. L’utilizzo di un bagno d’acqua esagonale consente l’osservazione del cuore attraverso sei diverse finestre planari, consentendo l’accoppiamento di più componenti ottici con meno distorsione per rifrazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un trattamento efficace delle tachiaritmie cardiache è la chiave per la terapia cardiaca. Tuttavia, i meccanismi biofisici alla base dell’inizio, della perpetuazione e della cessazione dell’aritmia non sono completamente compresi. Pertanto, la ricerca cardiaca mira a ottimizzare la terapia con scosse elettriche verso una cessazione più delicata delle aritmie, aumentando così la qualità della vita dei pazienti 28,29,30,31.<su…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Marion Kunze e Tina Althaus per il loro eccellente supporto tecnico durante gli esperimenti. La ricerca che ha portato ai risultati ha ricevuto finanziamenti dal Settimo programma quadro FP7/2007-2013 della Comunità europea con il numero di convenzione di sovvenzione HEALTH-F2-2009-241526. Il supporto è stato fornito anche dal Centro tedesco per la ricerca cardiovascolare, DZHK e.V. (progetto MD28), dal sito partner Goettingen, dalla Fondazione tedesca per la ricerca CRC 1002 (progetto C03) e dalla Max Planck Society. Questo lavoro è stato in parte supportato da BrainLinks-BrainTools, Cluster of Excellence finanziato dalla German Research Foundation (DFG, grant number EXC 1086).
Materials
| Chemical Components | |||
| Blebbistatin | TargetMol | T6038 | 10 mM stock solution |
| BSA/Albumin | Sigma-Aldrich | A4919 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | CaCl2 |
| Carbogen | Westfalen | 50 l bottle | |
| DI-4-ANBDQPQ | AAT Bioquest | 21499 | Dye for Optical Mapping |
| Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | C6H12O6 |
| Heparin | LEO Pharma | Heparin-Natrium Leo 25.000 I.E./5 ml, available only on prescription | |
| Hydrochlorid Acid | Merck | 1.09057.1000 | HCl, 1 M stock solution |
| Isoflurane | CP Pharma | 1 ml/ml, available only on prescription | |
| Magnesium Chloride | Merck | 8.14733.0500 | MgCl2 |
| Monopotassium Phosphate | Sigma-Aldrich | 30407 | KH2PO4 |
| Pinacidil monohydrate | Sigma-Aldrich | P154-500mg | 10 mM stock solution |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | KCl |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | NaHCO3 |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S5886 | NaCl |
| Sodium Hydroxide | Merck | 1.09137.1000 | NaOH, 1 M stock solution |
| Electrical Setup | |||
| Biopac MP150 | Biopac Systems | MP150WSW | data acquisition and analysis system |
| Custom-built ECG, alternative ECG100C | Biopac Systems | ECG100C | Electrocardiogram Amplifier |
| Custom-built water bath heater using heating cable | RMS Heating System | HK-5,0-12 | Heating cable 120W |
| Hexagonal water bath | |||
| LED Driver Power supply | Thorlabs | KPS101 | 15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube. |
| LEDD1B LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current |
| MAP, ECG Electrode | Hugo Sachs Elektronik | BS4 73-0200 | Mini-ECG Electrode for isoalted hearts |
| micro-LED Driver e.g. AFG | Agilent Instruments | A-2230 | Arbitrary function generator (AFG) |
| Signal Generator | Agilent Instruments | A-2230 | AFG |
| micro-LED Array Components | |||
| Epoxid glue | Epoxy Technology | EPO-TEK 353ND | Two component epoxy |
| Fluoropolymer | Asahi Glass Co. Ltd. | Cytop 809M | Fluoropolymer with high transparency |
| Image reversal photoresist | Merck KGaA | AZ 5214E | Image Reversal Resist for High Resolution |
| LED chip | Cree Inc. | C460TR2227-S2100 | Blue micro-LED |
| Photoresist | Merck KGaA | AZ 9260 | Thick Positive Photoresists |
| Polyimide | UBE Industries Ltd. | U-Varnish S | Polyimide Solution |
| Silicone | NuSil Technology LLC | MED-6215 | Low viscosity silicone elastomer |
| Solvent free adhesive | John P. Kummer GmbH | Epo-Tek 301-2 | Epoxy resin with low viscosity |
| Optical Mapping | |||
| Blue Filter | Chroma Technology Corporation | ET470/40x | Blue excitation filter |
| Camera | Photometrics | Cascade 128+ | High performance EMCCD Camera |
| Camera Objective | Navitar | DO-5095 | Navitar high speed fixed focal length lenses work with CCD and CMOS cameras |
| Dichroic Mirror | Semrock | FF685-Di02-25×36 | 685 nm edge BrightLine® single-edge standard epi-fluorescence dichroic beamsplitter |
| Emmision Filter | Semrock | FF01-775/140-25 | 775/140 nm BrightLine® single-band bandpass filter |
| Heatsink | Advanced Thermal Solutions | ATSEU-077A-C3-R0 | Heat Sinks – LED STAR LED Heatsink, 45mm dia., 68mm, Black/Silver, Unthreaded Baseplate Hardware |
| LED 1 and LED 2 | LED Engin Osram | LZ4-00B208 | High Power LEDs – Single Colour Blue, 460 nm 130 lm, 700mA |
| LED 3 | Thorlabs | M625L3 | 625 nm, 700 mW (Min) Mounted LED, 1000 mA |
| Lenses | LED Engin Osram | LLNF-2T06-H | LED Lighting Lenses Assemblies LZ4 LENS NARROW FLOOD BEAM |
| Photodiode for power meter | Thorlabs | S120VC | Standard Photodiode Power Sensor |
| Power Meter | Thorlabs | PM100D | Compact Power and Energy Meter |
| Red Filter | Semrock | FF02-628/40-25 | BrightLine® single-band bandpass filter |
References
- Davidenko, J. M., Pertsov, A. V., Salamonsz, R. Stationary and drifting spiral waves of excitation in isolated cardiac muscle. Nature. 355, 349-351 (1992).
- Fenton, F. H., et al. Termination of atrial fibrillation using pulsed low-energy far-field stimulation. Circulation. 120 (6), 467-476 (2009).
- Luther, S., et al. Low-energy control of electrical turbulence in the heart. Nature. 475, 235-239 (2011).
- Pumir, A., et al. Wave emission from heterogeneities opens a way to controlling chaos in the heart. Physical Review Letters. 99, 208101 (2007).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7, 897-900 (2010).
- Natasha, G., et al. et al.Channelrhodopsins: visual regeneration and neural activation by a light switch. New Biotechnology. 30 (5), 461-474 (2013).
- Zhang, F., et al. Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry. Nature. 446, 633-639 (2007).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. Journal of Neuroscience. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Ahmad, A., Ashraf, S., Komai, S. Optogenetics applications for treating spinal cord injury. Asian Spine Journal. 9 (2), 299-305 (2015).
- Dieter, A., Keppeler, D., Moser, T. Towards the optical cochlear implant: Optogenetic approaches for hearing restoration. EMBO Molecular Medicine. 12 (4), e11618 (2020).
- Keppeler, D., et al. Multichannel optogenetic stimulation of the auditory pathway using microfabricated LED cochlear implants in rodents. Science Translational Medicine. 12 (553), eabb8086 (2020).
- Verhoefen, M. K., Bamann, C., Blöcher, R., Förster, U., Bamberg, E. The photocycle of channelrhodopsin-2: ultrafast reaction dynamics and subsequent reaction steps. ChemPhysChem. 11 (14), 3113-3122 (2010).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized tool for optogenetics based on an LED and an optical fiber interfaced by a silicon housing. , 5252-5255 (2014).
- Schwaerzle, M., Elmlinger, P., Paul, O., Ruther, P. Miniaturized 3 x 3 optical fiber array for optogenetics with integrated 460 nm light sources and flexible electrical interconnection. , 162-165 (2015).
- Diaz-Maue, L., Schwaerzle, M., Ruther, P., Luther, S., Richter, C. Follow the light – From low-energy defibrillation to multi-site photostimulation. , 4832-4835 (2018).
- Zgierski-Johnston, C., et al. Cardiac pacing using transmural multi-LED probes in channelrhodopsin-expressing mouse hearts. Progress in Biophysics and Molecular Biology. , 51-61 (2020).
- . mouser.de, LED Engin, [Online] Available from: https://www.mouser.de/datasheet/2/228/5412893-LED_2520Engin_Datasheet_LuxiGen_LZ4-00B208 (2020)
- . thorlabs.com, thorlabs, [Online] Available from: https://www.thorlabs.com/_sd.cfm?fileName=25135-S01.pdf&partNumber=M625L3 (2020)
- Bruegmann, T., et al. Optogenetic defibrillation terminates ventricular arrhythmia in mouse hearts and human simulations. Journal of Clinical Investigation. 126 (10), 3894-3904 (2016).
- Richter, C., Christoph, J., Lehnart, S. E., Luther, S. Optogenetic light crafting tools for the control of cardiac arrhythmias. Methods in Molecular Biology. 1408, 293-302 (2016).
- Quiñonez Uribe, R. A., Luther, S., Diaz-Maue, L., Richter, C. Energy-reduced arrhythmia termination using global photostimulation in optogenetic murine hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1651), (2018).
- Moreno, I. LED irradiance pattern at short distances. Applied Optics. 59 (1), 190-195 (2020).
- Behrend, A., Bittihn, P., Luther, S. Predicting unpinning success rates for a pinned spiral in an excitable medium. , 345-348 (2010).
- Kappadan, V., et al. High-resolution optical measurement of cardiac restitution, contraction, and fibrillation dynamics in beating vs. blebbistatin-uncoupled isolated rabbit hearts. Frontiers in Physiology. 11 (464), (2020).
- Christoph, J., et al. Electromechanical vortex filaments during cardiac fibrillation. Nature. 555, 667-672 (2018).
- O’Shea, C. Cardiac optogenetics and optical mapping – Overcoming spectral congestion in all-optical cardiac electrophysiology. Frontiers in Physiology. 10 (182), (2019).
- Aras, K. K., Faye, N. R., Cathey, B., Efimov, I. R. Critical volume of human myocardium necessary to maintain ventricular fibrillation. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 11 (11), e006692 (2018).
- Trayanova, N., Doshi, A. N., Prakosa, A. How personalized heart modeling can help treatment of lethal arrhythmias: A focus on ventricular tachycardia ablation strategies in post-infarction patients. Wiley Interdisciplinary Reviews in System Biology and Medicine. 12 (3), 1477 (2020).
- Bingen, B., et al. Light-induced termination of spiral wave arrhythmias by optogenetic engineering of atrial cardiomyocytes. Cardiovascular Research. 104 (1), 194-205 (2014).
- Burton, R. A. B., et al. Optical control of excitation waves in cardiac tissue. Nature Photonics. 9 (12), 813-816 (2015).
- Dura, M., Schröder-Schetelig, J., Luther, S., Lehnart, S. E. Toward panoramic in situ mapping of action potential propagation in transgenic hearts to investigate initiation and therapeutic control of arrhythmias. Frontiers in Physiology. 5, 337 (2014).
- Crocini, C., et al. Optogenetics design of mechanistically-based stimulation patterns for cardiac defibrillation. Science Reports. 6 (35628), (2016).
- Nyns, E. C. A., et al. Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management. European Heart Journal. 38 (27), 2132-2136 (2017).
- Wilde, A. A. K+atp channel opening and arrhythmogenesis. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 24 (4), 35-40 (1994).
- Christoph, J., Luther, S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Frontiers in Physiology. 9 (1483), (2018).
- Christoph, J., Schröder-Schetelig, J., Luther, S. Electromechanical optical mapping. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 130(B), 150-169 (2017).
