Summary
Denne protokol beskriver proceduren for fjernelse af leverens ventral lap hos voksne zebrafisk for at gøre det muligt at studere leverregenerering.
Abstract
Leversvigt er en af de førende dødsårsager på verdensplan, og dødeligheden fra kronisk leversygdom stiger kraftigt i USA. Sunde lever er i stand til at regenerere fra giftige skader, men i fremskreden leversygdom er leverens naturlige evne til at regenerere nedsat. Zebrafisk er opstået som et stærkt eksperimentelt system til at studere regenerering. De er en ideel model til at studere leverregenerering fra delvis hepatektomi, en procedure med direkte klinisk relevans, hvor en del af leveren fjernes kirurgisk, hvilket efterlader resten intakt. Der er ingen standardprotokol for delvis hepatektomi. tidligere undersøgelser ved hjælp af denne model har brugt lidt forskellige protokoller og rapporteret forskellige resultater. Beskrevet her er en effektiv, reproducerbar protokol til udførelse af en delvis hepatektomi hos voksne zebrafisk. Vi bruger denne teknik til at demonstrere, at zebrafisk er i stand til epimorf regenerering af den resected lap. Denne protokol kan bruges til yderligere at afhøre de mekanismer, der kræves for leverregenerering i zebrafisk.
Introduction
Blandt de faste organer hos mennesker er leveren det eneste organ, der er i stand til regenerering1. Dette er kritisk, da leveren er et vigtigt organ, der er ansvarlig for vigtige metaboliske funktioner, energilagring, blod afgiftning, sekretion af plasmaproteiner og galdeproduktion2. Hepatocytter tabt på grund af giftige eller inflammatoriske skader erstattes primært via opdeling af de resterende hepatocytter1. En klassisk eksperimentel model til undersøgelse af leverregenerering er delvis hepatektomi, hvor individuelle lobes af leveren fjernes, hvilket efterlader de resterende lobesintakte 3. Denne procedure blev oprindeligt udviklet hos rotter, hvor ca. to tredjedele af levermassen fjernes. Efter delvis hepatektomi hos pattedyr forekommer kompenserende regenerering i de resterende lobes, indtil leveren genvinder sin oprindelige masse. Især erstatter pattedyrsleveren ikke de manglende lobes.
Zebrafisk (Danio rerio) repræsenterer en tractable model for at studere voksen organ regenerering4. Zebrafiskleveren, mens den er strukturelt forskellig fra pattedyrsleveren, består af de samme celletyper og tjener den samme funktion som hos pattedyr2. Det er sammensat af tre lapper, med to dorsale lobes og en enkelt ventral lap, der er fladt langs tarmen. Delvis hepatektomi er tidligere blevet udført i zebrafisk, med modstridende beretninger om den præcise form for regenerering. Typisk udføres en tredjedel delvis hepatektomi ved fjernelse af hele ventral lap. Indledende rapporter viste, at efter fjernelse af ventral lapen var den fuldt regenereret inden for en uge5,6,7, hvilket tyder på, at zebrafiskleveren i modsætning til pattedyrsleveren er i stand til epimorf regenerering. Efterfølgende undersøgelser viste , at fjernelse af ventral lap resulterede i kompenserende regenerering i dorsale lobes, snarere end regenerering af den manglende ventral lap, og i sidste ende inddrivelse af levermasse inden for en uge8,9. Transskriptionsprofilering af dorsale lobes efter resektion af ventral lap afslørede betydelige ændringer forbundet med kompenserende regenerering10. I betragtning af at tilstanden af leverregenerering kan variere med omfanget af skaden8, spekulerede vi på, at forskellene i resultaterne kan skyldes teknisk variation i den delvise hepatektomiprotokol mellem forskningsgrupper.
Denne protokol beskriver en procedure for udførelse af en tredjedel delvis hepatektomi på voksne zebrafisk ved at fjerne ventral lap. Denne teknik vil være værdifuld til vurdering af mekanismer til leverregenerering.
Protocol
Representative Results
Discussion
De anatomiske forskelle mellem zebrafisk og pattedyr modeller for lever regenerering udgør unikke udfordringer for lever resektion. Leveren i zebrafisk er tæt på hjertet og tarmen; utilsigtet skadelige begge organer resulterer i øget dødelighed. Zebrafiskleveren er ikke indkapslet, hvilket gør det vanskeligere at adskille fra tarmen. Leveren modtager næringsrige blod fra tarmen gennem portal vener. Hos pattedyr konvergerer vener, der forlader tarmen, på en primær portalåre, der derefter opdeles, når den kommer…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
I.M.O. understøttes af NIAAA (F32AA027135). W.G. understøttes af R01DK090311, R01DK105198, R24OD017870 og Claudia Adams Barr Program for Excellence in Cancer Research. W.G. er en Pew Scholar i biomedicinsk videnskab.
Materials
| 16% Paraformaldehyde Aqueous Solution, EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15700 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile | Corning | 352098 | |
| AS 82/220.R2 PLUS Analytical Balance | Bay State Scale & Systems, INC. | WL-104-1051 | |
| Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| EMS Kuehne Coverglass/Specimen Forceps | Electron Microscopy Sciences | 72997-07 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | Discovery.V8 | |
| Mastertop Cellulose Cleaning Scrub Sponge | Amazon | B07CBSM53Z | |
| PBS10X Liquid Conc 4L | EMD Millipore | 6505-4L | |
| Super Fine Micro Scissors, 3 1/4" straight | Biomedical Research Instruments | 11-1020 | |
| Tricaine methanesulfonate | Syndel | TRIC-M-GR-0010 | |
| Tween 20, Fisher BioReagents | Fischer Scientific | BP337-500 |
References
- Michalopoulos, G. K. Principles of liver regeneration and growth homeostasis. Comprehensive Physiology. 3, 485-513 (2013).
- Wang, S., Miller, S. R., Ober, E. A., Sadler, K. C. Making it new again: insight into liver development, regeneration, and disease from zebrafish research. Current Topics in Developmental Biology. 124, (2017).
- Michalopoulos, G. K., Bhushan, B. Liver regeneration: biological and pathological mechanisms and implications. Nature Reviews Gastroenterology and Hepatology. , (2020).
- Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends in Genetics. 29, 611-620 (2013).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Biologie du développement. 320, 161-174 (2008).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and Cellular Biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy. The FASEB Journal. 23, 3516-3525 (2009).
- Zhu, Z., Chen, J., Xiong, J. W., Peng, J. Haploinsufficiency of Def activates p53-dependent TGFβ signalling and causes scar formation after partial hepatectomy. PLoS One. 9, (2014).
- Feng, G., Long, Y., Peng, J., Li, Q., Cui, Z. Transcriptomic characterization of the dorsal lobes after hepatectomy of the ventral lobe in zebrafish. BMC Genomics. 16, 979 (2015).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. Journal of Cellular Physiology. 213, 286-300 (2007).
- Grisham, J. W. Organizational principles of the liver. The Liver: Biology and Pathobiology: Fifth Edition. , 1-15 (2009).
