हम क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी के साथ सीटू में मैक्रोमोलिक्यूल्स के उच्च-संकल्प संरचनात्मक अध्ययनों के लिए क्रायो-केंद्रित आयन बीम माइक्रोमशीचिंग द्वारा डुबकी जमे हुए जैविक नमूनों की लामेला तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। प्रस्तुत प्रोटोकॉल सैकरोमाइसेस सेर्विसियाके अंदर मैक्रोमॉलिक्यूल्स के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए उच्च स्तरीय लामेले को तैयार करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।
आज, क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-एट) एकमात्र तकनीक है जो सीटू मेंमैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स पर निकट-परमाणु संकल्प संरचनात्मक डेटा प्रदान कर सकती है। इस मामले के साथ एक इलेक्ट्रॉन की मजबूत बातचीत के कारण, उच्च संकल्प क्रायो-ईटी अध्ययन 200 एनएम से कम की मोटाई वाले नमूनों तक सीमित हैं, जो क्रायो-ईटी की प्रयोज्यता को केवल एक सेल के परिधीय क्षेत्रों तक सीमित करता है। पिछले दशक के दौरान क्रायो-केंद्रित आयन बीम माइक्रोमचिनिंग (क्रायो-एफआईबीएम) द्वारा पतली सेलुलर क्रॉस-सेक्शन की तैयारी शामिल है, जिसे बड़ी कोशिकाओं के इंटीरियर से क्रायो-ईटी डेटा के अधिग्रहण को सक्षम करने के लिए पेश किया गया था। हम सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में व्यापक उपयोग के साथ एक यूकेरियोटिक सेल के प्रोटोठी उदाहरण के रूप में सैकरोमाइसेस सेर्विसिया का उपयोग करते हुए एक नमूना विट्रीफाइड से सेलुलर लैमेल की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम कुछ कोशिकाओं के अलग पैच या एक TEM ग्रिड पर कोशिकाओं के एक सतत मोनोलेयर में एस cerevisiae के विट्रीफिकेशन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और इन दो नमूनों के लिए क्रायो-एफआईबी द्वारा लमेला तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं।
हाल ही में तकनीकी और सॉफ्टवेयर विकास ने पिछले दशक1,2 में संरचनात्मक जीव विज्ञान अनुसंधान में प्रमुख तकनीकों में से एक विट्रीफाइड जैविक नमूनों के इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी (क्रायो-ईएम) को बनाया है। क्रायो-ईएम के लिए एक नमूने की तैयारी में आमतौर पर एक शुद्ध प्रोटीन या नमूना वाहक (टेम ग्रिड) पर न्यूक्लिक एसिड के साथ प्रोटीन का एक जटिल आवेदन होता है, जिसके बाद अधिकांश तरल को फिल्टर पेपर के साथ हटाया जाता है, और एक नमूने की अवशिष्ट पतली परत के साथ ग्रिड की ठंड को तरल इथेन या प्रोपेन3 में डुबकी ती है . नमूना इस प्रकार एक पतली परत में तय किया जाता है (आमतौर पर <80 एनएम) एक पूरी तरह से हाइड्रेटेड राज्य में असंगत बफर की, निकट देशी स्थितियों में, और किसी भी रासायनिक निर्धारण या भारी धातु विषम की आवश्यकता के बिना। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में संरचनात्मक रूप से सजातीय नमूने की इमेजिंग के परिणामस्वरूप डेटा का परिणाम होता है जिसका उपयोग एकल कण विश्लेषण प्रोटोकॉल2का उपयोग करके निकट-परमाणु संकल्प पर मैक्रोमॉल्यूल की त्रि-आयामी संरचना के निर्धारण के लिए किया जा सकता है। इस तरह की इन विट्रो संरचना नमूना तैयारी के दौरान उपयोग की जाने वाली शर्तों और उपचार के तहत मैक्रोमॉल्यूल के प्रतिनिधित्व से मेल खाती है। यद्यपि इन विट्रो स्थितियों के तहत निर्धारित संरचनाएं आमतौर पर मैक्रोमॉल्यूल की पूरी तरह से कार्यात्मक स्थिति के अनुरूप होती हैं, लेकिन सेल के अंदर विभिन्न मैक्रोमॉलिक्यूल्स के बीच स्थानिक संबंधों को छवि देने की क्षमता संरचनात्मक डेटा को एक अतिरिक्त कार्यात्मक संदर्भ प्रदान करेगी।
क्रायो-इलेक्ट्रॉन टोमोग्राफी (क्रायो-एट) का उपयोग सीटू4,5 में प्लेओमोर्फिक वस्तुओं या मैक्रोमोलिक्यूलर कॉम्प्लेक्स के 3 डी वॉल्यूम को फिर से डिजाइन करने के लिए कियाजाताहै। क्रायो-ईटी का लाभ यह है कि त्रि-आयामी जानकारी एक एकल इकाई इमेजिंग द्वारा प्राप्त की जाती है। हालांकि, जिस संकल्प पर व्यक्तिगत मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स या ऑर्गेनेल्स देखे जाते हैं, वह बहुत सीमित है। इसलिए, क्रायो-एट डेटा6,7से 4-8 Å संकल्प मॉडल तक पहुंचने के लिए बड़ी संख्या में टोमोग्राम से एक ही संरचना के साथ मैक्रोमॉलिक्यूल्स (उप-टोमोग्रामऔसत,एसटीए) का औसत आवश्यक है। यह हाल ही में दिखाया गया है कि क्रायो-एट और एसटीए को सेलुलर पर्यावरण 7 के संदर्भ में राइबोसोम्स जैसी मैक्रोमॉलिकुलर मशीनों की उच्च-संकल्पसंरचनाओंका निर्धारण करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। हालांकि, नमूने की मोटाई से ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग सीमित है। सामान्य तौर पर, यह एकल-कण क्रायो-ईएम के लिए एक समस्या नहीं है जहां विट्रीफिकेशन स्थितियों का अनुकूलन अंततः बर्फ की पतली परत में नमूने को एम्बेड कर सकता है। दूसरी ओर, अधिकांश कोशिकाएं वास्तव में 300 केवी इलेक्ट्रॉन बीम के लिए इलेक्ट्रॉन पारदर्शी नहीं हैं। 300 केवी इलेक्ट्रॉनों के लिए विट्रीफाइड जैविक नमूनों में इनलेस्टिक मतलब मुक्त पथ लगभग 395 एनएम8है, जिसका अर्थ है कि क्रायो-एट अध्ययन अधिकांश कोशिकाओं के लिए सेलुलर परिधि तक सीमित हैं।
क्रायो-ईटी के लिए पर्याप्त मोटाई के लिए नमूने को पतला करने के लिए विभिन्न तकनीकों को विकसित किया गया था। क्रायो-अल्ट्रामाइक्रोटॉमी क्रायो-ईटी 9,10, 11 के लिए उपयुक्त 60-80 एनएम मोटी धाराओं को प्रदान करने के लिए तरल नाइट्रोजन तापमान (-196 डिग्री सेल्सियस) पर हीरे के चाकू के साथ नमूने के यांत्रिकटुकड़ाकरने की क्रिया का उपयोग करताहै। एक एकल कोशिका से कई वर्गों को तैयार किया जा सकता है और डेटा विश्लेषण अंततः सेल के बड़े हिस्से के लिए 3 डी संरचनात्मक जानकारी का उत्पादन कर सकता है। हालांकि, यांत्रिक टुकड़ा करने की क्रिया घुमावदार वर्गों, क्रेवस, या नमूना संपीड़न जैसी कई कलाकृतियों का कारण बन सकती है, जो परिणामस्वरूप संरचना को प्रभावित कर सकती है और क्रायो-एट डेटा10,11,12कोप्रभावित कर सकती है। क्रायो-केंद्रित आयन बीम माइक्रोमचिनिंग (क्रायो-एफआईबीएम) एक वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है जहां एक पतली सेलुलर अनुभाग एक बहु-चरण प्रक्रिया में जीए + आयनों (एफआईबी) के केंद्रित बीम का उपयोग करके नमूने के क्रमिक एब्लेशन द्वारा तैयार किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप 80-300 एनएम मोटी सेलुलर क्रॉस-सेक्शन (लैमेला)13,14, 15 . क्रायो-अल्ट्रामाइक्रोटॉमी के विपरीत, केवल एक लमेला एक एकल कोशिका से तैयार किया जाता है, जो इसकी मात्रा के ~ 0.3-3% का प्रतिनिधित्व करता है, और मिल्ड क्रॉस-सेक्शन में रुचि का क्षेत्र खोजने के लिए आमतौर पर कई कोशिकाओं की माइक्रोमशीचिंग आवश्यक है। इसके अलावा, पूरे वर्कफ़्लो का थ्रूप आजकल अभी भी काफी कम है, जो अक्सर 8 घंटे के क्रायो-एफआईबीएम सत्र से 6-8 उच्च गुणवत्ता वाले लैमेल तक सीमित है। दूसरी ओर, क्रायो-एफआईबीएम क्रॉस-सेक्शन किसी भी संपीड़न कलाकृतियों से रहित हैं और उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईटी के लिए उपयुक्त इनपुट प्रदान करते हैं। इसके अलावा, क्रायो-ईटी के लिए नमूना वाहक को लैमेला का हस्तांतरण आवश्यक नहीं है क्योंकि नमूना पूरे लैमेला तैयारी प्रक्रिया के दौरान टेम ग्रिड पर रखा जाता है और बाद में एक ही ग्रिड को TEM में स्थानांतरित किया जा सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि क्रायो-एफआईबीएम के थ्रूपुट में जल्द ही काफी सुधार होगा, मुख्य रूप से अपर्यवेक्षित लैमेला मिलिंग16, 17 के लिए सॉफ्टवेयर की उपलब्धता और चार्ज-कपल प्लाज्मा के सिद्धांत पर संचालित एफआईपी के उपयोग से, जो तेजी से सामग्री एब्लेशन का खर्च वहन करेगा।
सैकरोमाइसेस सेरेविसिया (खमीर) गोलाकार आकार और ~ 2-5 माइक्रोन के व्यास की यूकेरियोटिक कोशिकाएं हैं। इसके आकार, पहुंच, आनुवंशिकी, पीढ़ी के समय और सरल हेरफेर के लिए धन्यवाद, खमीर को बड़े पैमाने पर एस्चेरिचिया कोलाईके समान सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान अनुसंधान में एक यूकेरियोटिक मॉडल जीव के रूप में अध्ययन किया जाता है, जिसे जीवाणु विज्ञान में प्रोकैरियोटिक मॉडल जीव के रूप में अच्छी तरह से अध्ययन किया जाता है। खमीर को निलंबन में आसानी से सुसंस्कृत किया जा सकता है और कम समय (दोगुना समय 1 – 2 घंटे) में कोशिकाओं की एक उच्च मात्रा उत्पन्न होती है। इससे भी महत्वपूर्ण बात, खमीर पशु और संयंत्र कोशिकाओं के साथ एक जटिल आंतरिक सेलुलर संरचना के शेयरों जबकि एक छोटे से जीनोम गैर कोडिंग डीएनए की एक कम सामग्री के शामिल बनाए रखने । सीटू डेटा में उच्च-संकल्प से खमीर प्रोटेम का संरचनात्मक लक्षण वर्णन इस प्रकार साहित्य में उपलब्ध कार्यात्मक डेटा की व्यापक मात्रा के लिए एक यंत्रवादी विवरण प्रदान करने में मदद कर सकता है।
इसके साथ में, हम खमीर के नमूने पर सीटू क्रायो-ईटी डेटा के अधिग्रहण के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं, जो नमूना खेती से क्रायो-एफआईबीएम लामेला तैयारी तक सभी चरणों को कवर करता है, और क्रायो-ईटी डेटा अधिग्रहण के लिए ईटम में नमूना हस्तांतरण करता है।
क्रायो-ईटी के लिए सेलुलर नमूनों की तैयारी एक जटिल कार्यप्रवाह है जिसके लिए कई उच्च अंत उपकरणों के उपयोग की आवश्यकता होती है। नमूना गुणवत्ता को प्रत्येक तैयारी चरण के दौरान समझौता किया जा सकता है जो पूरे प्रोटोकॉल के थ्रूपुट को प्रभावित करता है। इसके अलावा, व्यक्तिगत उपकरणों के बीच नमूना हस्तांतरण की आवश्यकता नमूना संदूषण या विचलन का एक अतिरिक्त जोखिम बन गया है। इसलिए, नमूना तैयारी वर्कफ़्लो में व्यक्तिगत चरणों का अनुकूलन लैमेला तैयारी वर्कफ्लो के थ्रूपुट और प्रजनन क्षमता को बढ़ाने के लिए उच्च महत्व का है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल क्रायो-ईटी द्वारा सीटू में मैक्रोमॉलिकुलर कॉम्प्लेक्स के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए सैकरोमाइसेस सेर्विसिया की अनुकूलित तैयारी का वर्णन करता है।
प्रोटोकॉल दो प्रकार के खमीर नमूनों की तैयारी का वर्णन करता है जो मुख्य रूप से टेम ग्रिड पर कोशिकाओं की एकाग्रता में भिन्न होते हैं। दोनों खमीर नमूनों क्रायो-एट के लिए उच्च गुणवत्ता वाले lamellae मिले और नमूना प्रकार का चयन विशेष अध्ययन के लक्ष्यों के अनुसार किया जा सकता है । खमीर पहले मामले में ग्रिड की सतह पर बेतरतीब ढंग से बिखरे हुए कुछ कोशिकाओं के अलग समूहों बनाता है, जबकि कोशिकाओं का एक सतत मोनोलेयर दूसरे नमूना प्रकार के लिए TEM ग्रिड सतह पर मौजूद है । पूर्व सामग्री की छोटी मात्रा के लिए तेजी से लैमेला तैयारी धन्यवाद के लिए उपयुक्त है जिसे दूर किया जाना चाहिए। अंतिम लैमेला काफी कम है, और इसलिए, इसमें केवल 2-4 सेलुलर क्रॉस-सेक्शन शामिल हैं। नमूना तैयार करने के लिए उपयुक्त क्षेत्रों को ग्रिड वर्गों सहित ग्रिड सतह पर बेतरतीब ढंग से वितरित किया जाता है, जो आंशिक रूप से लामेला तैयारी वर्कफ्लो के स्वचालन को प्रतिबंधित कर सकता है। नमूने के उत्तरार्द्ध प्रकार के समग्र मिलिंग समय को बनाए रखने के लिए प्रारंभिक मिलिंग चरण के दौरान बड़ी धाराओं के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, इस प्रकार के नमूने में कलाकृतियों का अधिक खतरा होता है जो असमान मिलिंग (पर्दा) से उपजी होती हैं। इसलिए, जीआईएस को एक मोटा सुरक्षात्मक परत बनाने के लिए छोटे सेलुलर समूहों के साथ नमूने के मामले की तुलना में 50% लंबी अवधि के लिए नमूना सतह पर उड़ जाता है। इसके बाद, नमूने को जीआईएस परत का इलाज करने, इसे कठोर बनाने और नमूना सतह चालकता बढ़ाने के लिए इरिडियम (वैकल्पिक रूप से प्लेटिनम या सोने) की एक अतिरिक्त परत के साथ उड़ जाता है। किसी न किसी लामेला मिलिंग के पहले कदम के दौरान लैमेला (लमेलेला एज से ~ 2-5 माइक्रोन) के प्रत्येक पक्ष पर अतिरिक्त क्षेत्रों के FIBM को अंतिम क्रॉस-सेक्शन23में कम तनाव के कारण टूटे हुए लैमेले की संख्या को कम करने के लिए फायदेमंद पाया गया था। अंतिम लैमेला लंबा है और इसमें ~ 10 सेलुलर क्रॉस-सेक्शन शामिल हैं, जो क्रायो-ईटी के लिए उपयुक्त क्षेत्रों की संख्या बढ़ाते हैं। कोशिकाओं के बीच मध्यम या बफर के अनुचित विट्रीफिकेशन को बफर समाधान (इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले 5% ग्लिसरोल) के क्रायो-संरक्षित के अलावा आसानी से क्षीण किया जा सकता है। चूंकि अधिकांश वर्ग लामेला तैयारी के लिए उपयुक्त हैं, इसलिए निरंतर मोनोलेयर में व्यवस्थित कोशिकाओं के साथ नमूना अपर्यवेक्षित लैमेला तैयारी के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
लामेला तैयारी वर्कफ्लो में एक और महत्वपूर्ण पहलू ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप में स्थानांतरण और माइक्रोस्कोप चरण झुकाव धुरी के लिए लैमेला की उचित स्थिति है। इष्टतम, लैमेला मुख्य धुरी माइक्रोस्कोप की झुकाव धुरी के लिए लंबवत है जो चित्रित क्षेत्र की ऊंचाई पर ट्रैकिंग और ध्यान केंद्रित करता है और लामेला किनारों को उच्च झुकाव कोणों पर देखने के क्षेत्र को बचाने से रोकता है। खुराक-सममित योजना का उपयोग करके क्रायो-ईटी डेटा एकत्र करते समय,18 नमूने को शुरू में माइक्रोस्कोप में घुमाया जाना चाहिए ताकि ग्रिड विमान के संबंध में लैमेला के झुकाव की भरपाई की जा सके।
The authors have nothing to disclose.
इस काम को यूरोपीय आयोग के क्षितिज 2020 कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित निर्देश-अल्ट्रा (ग्रांट 731005), iNEXT-डिस्कवरी (ग्रांट 871037) और सीआईआईएसबी अनुसंधान बुनियादी ढांचा, एक निर्देश-एरिक सेंटर (LM2018127) का समर्थन किया गया था। हम थर्मो फिशर साइंटिफिक ब्रानो से प्राप्त समर्थन को स्वीकार करते हैं।
Agar | Himedia | MB053 | |
Glucose | PENTA | 12020-31000 | |
Glycerol | Merck | G5516-1L | |
ethane | Messer | 1007 | |
LN2 | Lineq | LN2-1L | |
Peptone | Merck | P5905-1KG | |
Saccharomyces cerevisiae | ATCC | 201388 | strain BY4741 |
Tweezers | Dumont | T539 | |
Yeast extract | Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Disposable | |||
Blotting papers | Ted Pella | 47000-10 | |
C-clip | ThermoScientific | 9432 909 97551 | |
C-clip ring | ThermoScientific | 9432 909 97561 | |
Spreading sticks | Merck | Z376779-1PAK | |
Sterile inoculation loops | BRAND | BR452201-1000EA | |
Sterile plastic Petri dishes | Sigma | SIAL0166 | |
TEM grids | Quantifoil | 4420G-XA | |
Equipment | |||
Autoclave | Systec | 101291545 | |
balances | BEL | M124A | |
Cryo-FIB/SEM microscope | ThermoScientific | 1006123 | |
Cryo-TEM microscope | ThermoScientific | 9432 057 03301 | |
Laminar flow box | Telstar | AH5 | |
Plasma cleaner | Gatan | 955.82001 | |
Shaking incubator | New Brunswick | M1282-0002 | |
UV/VIS spectrophotometer | WPA | S800 | |
Vitrification robot | ThermoScientific | 9432 053 50621 |