Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

Résumé

Nous présentons un protocole pour la caractérisation de la motilité et du comportement d’une population de cellules de taille cent microns à millimètres en utilisant la microscopie à fond clair et le suivi cellulaire. Ce test révèle que Stentor coeruleus passe par quatre phases comportementalement distinctes lors de la régénération d’un appareil buccal perdu.

Résumé

Stentor coeruleus est un organisme modèle bien connu pour l’étude de la régénération unicellulaire. L’analyse transcriptomique de cellules individuelles a révélé des centaines de gènes – dont beaucoup ne sont pas associés à l’appareil buccal (OA) – qui sont régulés différemment par phases tout au long du processus de régénération. On a émis l’hypothèse que cette réorganisation systémique et cette mobilisation des ressources cellulaires vers la croissance d’une nouvelle arthrose entraîneront des changements observables dans le mouvement et le comportement correspondant dans le temps aux phases d’expression différentielle des gènes. Cependant, la complexité morphologique de S. coeruleus a nécessité le développement d’un test pour capturer les statistiques et l’échelle de temps. Un script personnalisé a été utilisé pour suivre les cellules dans de courtes vidéos, et des statistiques ont été compilées sur une grande population (N ~ 100). Lors de la perte de l’OA, S. coeruleus perd initialement la capacité de mouvement dirigé; puis à partir de ~4 h, il présente une baisse significative de vitesse jusqu’à ~8 h. Ce test fournit un outil utile pour le dépistage des phénotypes de motilité et peut être adapté pour l’étude d’autres organismes.

Introduction

Stentor coeruleus (Stentor) est un organisme modèle bien connu qui a été utilisé pour étudier la régénération unicellulaire en raison de sa grande taille, de sa capacité à résister à plusieurs techniques microchirurgicales et de sa facilité de culture en laboratoire ^1,2,3. Les premières études de régénération se sont concentrées sur la caractéristique la plus importante et la plus morphologiquement distincte de Stentor – l’ARTH – qui est complètement éliminée lors ^{d’un choc chimique 4,5,6}

Protocole

NOTE: Une population d’environ cent cellules de S. coeruleus a été cultivée conformément à un protocole JoVE⁸ publié précédemment.

1. Préparation de l’échantillon

1. Coupez un morceau de feuille d’espacement en silicone de 250 μm d’épaisseur (table des matériaux) légèrement plus petit en hauteur et en largeur qu’une lame de microscope. À l’aide d’un poinçon de trou de 5/16 », créez des puits circulaires. Veillez à laisser suffisamment d’espace entre les puits voisins pour assurer une bonne étanchéité.
   NOTE : Un espace de 3 mm entre les puits voisins s’est avéré suffisant. Avec de l....

Résultats

L’objectif de ce test est de quantifier le changement progressif des schémas de mouvement et l’augmentation progressive de la vitesse de mouvement des cellules au sein d’une grande population de stentors régénérants (N ~ 100). Pour faciliter l’interprétation des résultats, le code personnalisé inclus dans ce protocole génère deux types de tracés : une superposition de toutes les traces de mouvement des cellules dans un ensemble de données vidéo (Figure 1C-F<.......

Discussion

De nombreux algorithmes de suivi des particules et des cellules existent actuellement, certains entièrement gratuits. Le coût et la convivialité sont souvent des compromis qui nécessitent des compromis. De plus, de nombreux programmes de suivi cellulaire existants sont conçus pour suivre le mouvement lent des cellules de culture tissulaire, plutôt que le mouvement de nage rapide de Stentor, qui tourne pendant la natation et peut subir des changements soudains de direction. Après avoir testé bon nombre de ces opt.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feuille de silicone de 0,25 mm d’épaisseur	Grace Bio-Labs	CWS-S-0.25
24 x 50 mm, verre de protection #1.5	Fisher Scientific	NC1034527	Comme indiqué dans la discussion, un verre de protection plus petit peut être utilisé si moins de puits d’échantillon sont placés sur une lame.
Caméra			Nous avons utilisé Nikon D750
Chlamydomonas 137c WT souche	Chlamydomonas Resource Center	CC-125
MATLAB	MATHWORKS
MATLAB Image Processing Toolbox	MATHWORKS		nécessaire pour TrackCells.m et CleanTraces.m

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