Analyse af stentors motilitetsmønstre under og efter oral apparatregenerering ved hjælp af cellesporing
Summary
Vi præsenterer en protokol til karakterisering af bevægelighed og opførsel af en population på hundrede mikron- til millimeterstore celler ved hjælp af brightfieldmikroskopi og cellesporing. Dette assay afslører, at Stentor coeruleus overgår gennem fire adfærdsmæssigt forskellige faser, når man regenererer et tabt oralt apparat.
Abstract
Stentor coeruleus er en velkendt modelorganisme til undersøgelse af encellet regenerering. Transkriptomisk analyse af individuelle celler afslørede hundredvis af gener – mange ikke forbundet med det orale apparat (OA) – der er differentieret reguleret i faser gennem regenereringsprocessen. Det blev antaget, at denne systemiske omorganisering og mobilisering af cellulære ressourcer mod vækst af en ny OA vil føre til observerbare ændringer i bevægelse og adfærd svarende i tid til faserne af differentiel genekspression. Den morfologiske kompleksitet af S. coeruleus nødvendiggjorde imidlertid udviklingen af et assay for at fange statistikken og tidsskalaen. Et brugerdefineret script blev brugt til at spore celler i korte videoer, og statistikker blev udarbejdet over en stor befolkning (N ~ 100). Ved tab af OA mister S. coeruleus oprindeligt evnen til rettet bevægelse; derefter starter ved ~ 4 timer, udviser det et betydeligt fald i hastighed indtil ~ 8 timer. Dette assay giver et nyttigt værktøj til screening af motilitetsfænotyper og kan tilpasses til undersøgelse af andre organismer.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) er en velkendt modelorganisme, der er blevet brugt til at studere encellet regenerering på grund af dens store størrelse, evne til at modstå flere mikrokirurgiske teknikker og lette dyrkning i en laboratorieindstilling 1,2,3. Tidlige regenereringsundersøgelser fokuserede på det største og mest morfologisk forskellige træk i Stentor – OA – som kastes fuldstændigt på kemisk chok 4,5,6. De novo udskiftning af en tabt OA begynder med fremkomsten af et nyt membranellarbånd – en række cilia, der gradvist skifter mod den forreste del af cellen, før de danner en funktionel OA over otte morfologiske stadier3. Disse stadier er blevet observeret sekventielt, uanset temperatur, og giver et universelt referencepunkt for næsten alle undersøgelser5.
Mekanistisk analyse af Stentor-regenerering kræver værktøjer til måling af tidspunktet for regenerering, der er robuste og enkle nok til at blive anvendt på flere prøver som en del af en kemisk eller molekylær skærm. Standardmetoden til udførelse af et cellebaseret assay er billeddannelse, i dette tilfælde billeddannelse af dannelsen af ny OA under regenerering. Sådanne billedbaserede assays er imidlertid mest effektive, når den regenererende struktur indeholder forskellige molekylære komponenter, der kan bruges som markører, så de let kan detekteres i et fluorescensbillede. I tilfælde af Stentor OA er de kendte komponenter (cilia, basale kroppe) også til stede på resten af celleoverfladen; derfor kan anerkendelse af genoprettelsen af OA ikke opnås blot ved at lede efter tilstedeværelsen eller fraværet af en komponent.
Snarere ville en formgenkendelse være påkrævet for at detektere en OA, og dette er potentielt meget udfordrende i betragtning af det faktum, at Stentor-celler ofte ændrer form via en hurtig kontraktil proces. Dette papir præsenterer et alternativt assay til regenerering, der er afhængig af kroppens bevægelige aktivitet og OA-cilia. Når OA regenererer, gennemgår de nydannede cilier reproducerbare ændringer i position og aktivitet, hvilket igen påvirker cellens svømmemotilitet. Ved at analysere bevægelighed er det muligt at udføre et assay for “funktionel regenerering”, der kvantificerer regenerering ved at kvantificere funktionen af de regenererede strukturer. Tidligere analyse af Stentor ciliary funktion under regenerering anvendte partikelbilled velocimetri kombineret med sporstofperler tilsat til det eksterne medie for at observere ændringer i strømningsmønster på forskellige stadier af regenerering7; Denne tilgang kræver imidlertid besværlig billeddannelse af individuelle celler og deres tilknyttede strømningsfelter, en ad gangen.
Ved at bruge selve cellens bevægelse som en proxy for cilia-genereret flow ville det være muligt at analysere et større antal celler parallelt ved hjælp af billeddannelsessystemer med lav opløsning, der er kompatible med screeningsplatforme med høj kapacitet. Dette assay kan i princippet bruges til at studere udvikling og funktionel regenerering i andre svømmeorganismer i hundredvis af mikrometer til millimeter størrelse skala. Afsnit 1 i protokollen beskriver konstruktionen af et multiwell-prøveglas, som muliggør billeddannelse med høj kapacitet af en population af celler over op til en hel dag. Der gives oplysninger om, hvordan du justerer til brug med andre celletyper. Afsnit 2 i protokollen dækker erhvervelse af videodata til dette assay, som kan udføres på et dissektionsmikroskop med et digitalt spejlreflekskamera med en enkelt linse. Afsnit 3 i protokollen giver en gennemgang af cellesporing og cellehastighedsberegning ved hjælp af MATLAB-kode (supplerende oplysninger). Afsnit 4 i protokollen forklarer, hvordan man omdanner de numeriske resultater til plots som vist i figur 1C-F og figur 2C for nem fortolkning af resultaterne.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der findes i øjeblikket mange partikel- og cellesporingsalgoritmer, nogle helt gratis. Omkostninger og brugervenlighed er ofte kompromiser, der kræver kompromis. Derudover er mange af de eksisterende cellesporingsprogrammer designet til at spore langsom kravlende bevægelse af vævskulturceller snarere end stentors hurtige svømmebevægelse, som roterer under svømning og kan gennemgå pludselige retningsændringer. Efter at have testet mange af disse muligheder er protokollen, der præsenteres her, beregnet t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS). Vi anerkender Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo og Skylar Widman for at hjælpe med nogle af de indledende analyser og kodetest. Vi takker Mark Slabodnick for diskussion og forslag. WFM anerkender støtte fra NIH-bevilling R35 GM130327.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
- Lillie, F. R. On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Tartar, V., Kerkut, G. A. . The Biology of Stentor. , (1961).
- Tartar, V. Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium. Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).
- Kelleher, J. K. A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus. Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), 1001861 (2014).
- Wan, K. Y., et al. Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167 (2020).
- Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. Methods for the study of regeneration in Stentor. Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759 (2018).
- Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus. bioRxiv. , 240788 (2017).
- Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration. Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).
