Análisis de los patrones de motilidad del estentor durante y después de la regeneración del aparato oral mediante el seguimiento celular
Summary
Presentamos un protocolo para la caracterización de la motilidad y el comportamiento de una población de células de cien micras a milímetros utilizando microscopía de campo brillante y seguimiento celular. Este ensayo revela que Stentor coeruleus pasa por cuatro fases conductualmente distintas al regenerar un aparato oral perdido.
Abstract
Stentor coeruleus es un organismo modelo bien conocido para el estudio de la regeneración unicelular. El análisis transcriptómico de células individuales reveló cientos de genes, muchos no asociados con el aparato oral (OA), que están regulados diferencialmente en fases a lo largo del proceso de regeneración. Se planteó la hipótesis de que esta reorganización sistémica y movilización de recursos celulares hacia el crecimiento de una nueva OA conducirá a cambios observables en el movimiento y el comportamiento correspondientes en el tiempo a las fases de expresión génica diferencial. Sin embargo, la complejidad morfológica de S. coeruleus requirió el desarrollo de un ensayo para capturar las estadísticas y la escala de tiempo. Se utilizó un script personalizado para rastrear celdas en videos cortos, y se compilaron estadísticas sobre una gran población (N ~ 100). Tras la pérdida de la OA, S. coeruleus inicialmente pierde la capacidad de movimiento dirigido; luego, a partir de ~ 4 h, exhibe una caída significativa en la velocidad hasta ~ 8 h. Este ensayo proporciona una herramienta útil para el cribado de fenotipos de motilidad y puede ser adaptado para la investigación de otros organismos.
Introduction
Stentor coeruleus (Stentor) es un organismo modelo bien conocido que se ha utilizado para estudiar la regeneración unicelular debido a su gran tamaño, capacidad para soportar varias técnicas microquirúrgicas y facilidad de cultivo en un entorno de laboratorio 1,2,3. Los primeros estudios de regeneración se centraron en la característica más grande y morfológicamente distinta de Stentor, la OA, que se elimina por completo tras el choque químico 4,5,6. El reemplazo de novo de una OA perdida comienza con la aparición de una nueva banda de membranalar, una serie de cilios que se desplazan gradualmente hacia la parte anterior de la célula antes de formar una OA funcional durante ocho etapas morfológicas3. Estas etapas se han observado secuencialmente, independientemente de la temperatura, y proporcionan un punto de referencia universal para casi todos los estudios5.
El análisis mecanicista de la regeneración del stentor requiere herramientas para medir el momento de la regeneración que sean lo suficientemente robustas y simples como para aplicarse a múltiples muestras como parte de una pantalla química o molecular. El método estándar para realizar un ensayo basado en células es la obtención de imágenes, en este caso, la obtención de imágenes de la formación de nueva OA durante la regeneración. Sin embargo, tales ensayos basados en imágenes son más efectivos cuando la estructura regeneradora contiene distintos componentes moleculares que se pueden usar como marcadores, de modo que se detecten fácilmente en una imagen de fluorescencia. En el caso del Stentor OA, los componentes conocidos (cilios, cuerpos basales) también están presentes en el resto de la superficie celular; por lo tanto, reconocer la restauración de la OA no puede lograrse simplemente buscando la presencia o ausencia de un componente.
Más bien, se requeriría alguna forma de reconocimiento de forma para detectar una OA, y esto es potencialmente muy desafiante dado el hecho de que las células stentor a menudo cambian de forma a través de un proceso contráctil rápido. Este artículo presenta un ensayo alternativo para la regeneración que se basa en la actividad móvil del cuerpo y los cilios de OA. A medida que la OA se regenera, los cilios recién formados experimentan cambios reproducibles en la posición y la actividad, lo que a su vez, afecta la motilidad de natación de la célula. Mediante el análisis de la motilidad, es posible realizar un ensayo de “regeneración funcional” que cuantifica la regeneración cuantificando la función de las estructuras regeneradas. El análisis previo de la función ciliar del stentor durante la regeneración utilizó la velocimetría de imagen de partículas, combinada con perlas trazadoras agregadas a los medios externos, para observar cambios en el patrón de flujo en diferentes etapas de la regeneración7; sin embargo, este enfoque requiere imágenes laboriosas de células individuales y sus campos de flujo asociados, uno a la vez.
Al utilizar el movimiento de la propia célula como un proxy para el flujo generado por los cilios, sería posible analizar un mayor número de células en paralelo, utilizando sistemas de imágenes de baja resolución compatibles con plataformas de detección de alto rendimiento. Este ensayo puede, en principio, ser utilizado para estudiar el desarrollo y la regeneración funcional en otros organismos nadadores en la escala de tamaño de cientos de micras a milímetros. La sección 1 del protocolo describe la construcción de un portaobjetos de muestra de múltiples pozos, que permite obtener imágenes de alto rendimiento de una población de células durante un día entero. Se proporcionan detalles sobre cómo ajustar para su uso con otros tipos de células. La sección 2 del protocolo cubre la adquisición de datos de video para este ensayo, que se puede lograr en un microscopio de disección con una cámara réflex digital de lente única. La sección 3 del protocolo proporciona un recorrido por el seguimiento de celdas y el cálculo de la velocidad de las celdas utilizando el código MATLAB (Información complementaria). La Sección 4 del protocolo explica cómo convertir los resultados numéricos en gráficos como se muestra en la Figura 1C-F y la Figura 2C para facilitar la interpretación de los resultados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actualmente existen muchos algoritmos de seguimiento de partículas y células, algunos completamente gratuitos. El costo y la facilidad de uso a menudo son compensaciones que requieren compromiso. Además, muchos de los programas de seguimiento celular existentes están diseñados para rastrear el movimiento lento de rastreo de las células de cultivo de tejidos, en lugar del movimiento de natación rápida de Stentor, que gira mientras nada y puede sufrir cambios repentinos de dirección. Después de probar mu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado, en parte, por el Laboratorio de Biología Marina Whitman Early Career Fellowship (JYS). Reconocemos a Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo y Skylar Widman por ayudar con algunos de los análisis preliminares y las pruebas de código. Agradecemos a Mark Slabodnick por la discusión y las sugerencias. WFM reconoce el apoyo de la subvención R35 GM130327 de los NIH.
Materials
| 0.25 mm-thick silicone sheet | Grace Bio-Labs | CWS-S-0.25 | |
| 24 x 50 mm, #1.5 coverglass | Fisher Scientific | NC1034527 | As noted in Discussion, smaller coverglass can be used if fewer sample wells are placed on one slide. |
| CCD camera | We used Nikon D750 | ||
| Chlamydomonas 137c WT strain | Chlamydomonas Resource Center | CC-125 | |
| MATLAB | MATHWORKS | ||
| MATLAB Image Processing Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m and CleanTraces.m | |
| MATLAB Statistics and Machine Learning Toolbox | MATHWORKS | needed for TrackCells.m | |
| Microscope with camera port | We used Zeiss AxioZoom v1.6 and Leica S9E | ||
| Pasteurized Spring Water | Carolina | 132458 | |
| TAP Growth Media | ThermoFisher Scientific | A1379801 | Can also be made for much cheaper following recipe from Chlamy Resource Center |
References
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