JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Résultats
Discussion
Divulgations
Acknowledgements
Materials
References
Traduction automatique
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bio-ingénierie

تجميع درجة الحرارة التي تسيطر عليها وتوصيف ثنائي واجهة قطرة

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

يفصل هذا البروتوكول استخدام نظام تسخين يتم التحكم في درجة حرارته لتعزيز تجميع الطبقة الأحادية الدهنية وتشكيل طبقة ثنائية واجهة القطيرات للدهون ذات درجات حرارة ذوبان مرتفعة ، وقياسات السعة لتوصيف التغيرات التي تحركها درجة الحرارة في الغشاء.

Abstract

طريقة ثنائية الطبقة واجهة القطيرات (DIB) لتجميع الطبقات ثنائية الدهون (أي DIBs) بين قطرات مائي مطلي بالدهون في النفط يوفر فوائد رئيسية مقابل أساليب أخرى: DIBs مستقرة وطويلة الأمد في كثير من الأحيان ، يمكن ضبطها بشكل عكسي ، ويمكن التحكم بسهولة في عدم تناسق المنشورات عبر التراكيب القطيرة ، ويمكن الحصول على شبكات تشبه الأنسجة من الطبقات الثنائية عن طريق العديد من القطرات المجاورة. تشكيل DIBs يتطلب التجميع التلقائي من الدهون في monolayers الدهون عالية الكثافة على أسطح قطرات. في حين أن هذا يحدث بسهولة في درجة حرارة الغرفة للدهون الاصطناعية الشائعة ، فإن طبقة أحادية كافية أو طبقة ثنائية مستقرة تفشل في التشكل في ظروف مماثلة للدهون مع نقاط انصهار فوق درجة حرارة الغرفة ، بما في ذلك بعض مقتطفات الدهون الخلوية. وقد حد هذا السلوك على الأرجح من تكوينات – وربما الصلة البيولوجية – ل DIBs في دراسات الأغشية النموذجية. لمعالجة هذه المشكلة ، يتم تقديم بروتوكول تجريبي لتسخين خزان النفط الذي يستضيف قطرات DIB بعناية وتوصيف آثار درجة الحرارة على غشاء الدهون. على وجه التحديد، يظهر هذا البروتوكول كيفية استخدام لاعبا اساسيا الألومنيوم موصل حراريا وعناصر التدفئة المقاومة التي تسيطر عليها حلقة التغذية المرتدة لوصف درجات حرارة مرتفعة، مما يحسن تجميع أحادي الطبقة وتشكيل طبقة ثنائية لمجموعة أوسع من أنواع الدهون. يتم قياس الخصائص الهيكلية للغشاء ، وكذلك انتقالات المرحلة الحرارية من الدهون التي تتألف من الطبقة الثنائية ، من خلال قياس التغيرات في السعة الكهربائية للبنك. معا، يمكن أن يساعد هذا الإجراء في تقييم الظواهر الفيزيائية الحيوية في الأغشية النموذجية على درجات حرارة مختلفة، بما في ذلك تحديد درجة حرارة ذوبان فعالة(TM)لخليط الدهون متعدد المكونات. وبالتالي فإن هذه القدرة ستسمح بتكرار أقرب لتحولات المرحلة الطبيعية في أغشية النموذج وتشجع على تكوين واستخدام أغشية نموذجية من رقعة أوسع من مكونات الأغشية، بما في ذلك تلك التي تلتقط بشكل أفضل عدم تجانس نظيراتها الخلوية.

Introduction

الأغشية الخلوية هي حواجز نفاذية بشكل انتقائي تتألف من الآلاف من أنواع الدهون1والبروتينات والكربوهيدرات والستريول التي تغلف وتقسم جميع الخلايا الحية. فهم كيفية تأثير تكويناتها على وظائفها والكشف عن كيفية تفاعل الجزيئات الطبيعية والاصطناعية مع الأغشية الخلوية والتمسك بها وتعطيلها ونقلها هي ، لذلك ، مجالات مهمة من الأبحاث ذات الآثار واسعة النطاق في البيولوجيا والطب والكيمياء والفيزياء وهندسة المواد.

هذه الأهداف لاكتشاف تستفيد مباشرة من تقنيات ثبت لتجميع والتلاعب، ودراسة الأغشية النموذجية – بما في ذلك الطبقات ثنائية الدهون تجميعها من الدهون الاصطناعية أو التي تحدث بشكل طبيعي – التي تحاكي تكوين وهيكل وخصائص النقل من نظرائهم الخلوية. في السنوات الأخيرة، وقد تلقى ثنائي الطبقة واجهة قطرة (DIB) طريقة2،3،4 لبناء ثنائي الطبقة الدهنية بلانار بين قطرات الماء المغلفة بالدهون في النفط اهتماما كبيرا5،6،7،8،9،10،11،2 12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22،23، وقد أظهرت مزايا عملية على النهج الأخرى لتشكيل غشاء النموذج: طريقة DIB بسيطة الأداء ، لا يتطلب أي تصنيع أو إعداد متطور (على سبيل المثال، “اللوحة”) من الركيزة لدعم الغشاء، تسفر باستمرار الأغشية مع متفوقة طول العمر، ويسمح لقياسات الكهربية القياسية، ويبسط تشكيل الأغشية النموذجية مع التراكيب منشور غير المتماثلة3. لأن ثنائي الطبقات أشكال عفويا بين قطرات ويمكن تصميم كل قطرة في الموقف والماكياج، وقد اجتذبت تقنية بنك الاستثمار الإسلامي أيضا اهتماما كبيرا في تطوير أنظمة المواد المستوحاة من الخلايا التي تبني على استخدام الأغشية المتجاوبة مع المحفزات18و24و25و26و27و28و2829، تقسيم متوازن ونقل14،30،31، ومواد تشبه الأنسجة17،23،32،33،34،35،36.

أجريت غالبية التجارب المنشورة على أغشية نموذجية، بما في ذلك تلك التي تحتوي على ثنائي الفينيل متعدد المستويات، في درجة حرارة الغرفة (RT، ~20-25 درجة مئوية) ومع عدد قليل من الدهون الاصطناعية (على سبيل المثال، DOPC، DPhPC، الخ). تحد هذه الممارسة من نطاق الأسئلة الفيزيائية الحيوية التي يمكن دراستها في الأغشية النموذجية ، وبناء على الملاحظة ، يمكن أن تحد أيضا من أنواع الدهون التي يمكن استخدامها لتجميع ثنائيات الفينيل متعددة الدهون. على سبيل المثال، الدهون الاصطناعية مثل DPPC، التي لديها درجة حرارة ذوبان 42 درجة مئوية، لا تجمع monolayers معبأة بإحكام أو شكل DIBs في RT37. وقد ثبت أيضا تشكيل DIB في درجة حرارة الغرفة من الصعب على المستخلصات الطبيعية، مثل تلك من الثدييات (على سبيل المثال، استخراج الدهون مجموع الدماغ، BTLE)38 أو البكتيريا (على سبيل المثال، اسشيريتشيا القولونية مجموع استخراج الدهون، ETLE)37،والتي تحتوي على العديد من أنواع مختلفة من الدهون وتنشأ من الخلايا التي تتواجد في درجات حرارة مرتفعة (37 درجة مئوية). وبالتالي فإن دراسة التركيبات المتنوعة تتيح فرصا لفهم العمليات التي يتم التوسط فيها بالأغشية في الظروف ذات الصلة بيولوجيا.

رفع درجة حرارة الزيت يمكن أن يخدم غرضين: أنه يزيد من حركية التجمع أحادي الطبقة ويمكن أن يسبب الدهون للخضوع لعملية انتقال ذوبان للوصول إلى مرحلة اضطراب السائل. كلا العواقب المساعدة في تجميع أحادية الطبقة39، وهو شرط مسبق لDIB. بالإضافة إلى التدفئة لتشكيل ثنائي الطبقة ، يمكن استخدام تبريد الغشاء بعد التشكيل لتحديد التحولات الحرارية في ثنائيات الدهون المفردة38، بما في ذلك تلك الموجودة في مخاليط الدهون الطبيعية (على سبيل المثال ، BTLE) التي يمكن أن يكون من الصعب اكتشافها باستخدام قياس السعرات الحرارية. وبصرف النظر عن تقييم التحولات الحرارية من الدهون، يمكن استخدام تغيير درجة حرارة DIB بدقة لدراسة التغيرات الناجمة عن درجة الحرارة في هيكل الغشاء38 ودراسة كيفية تأثير تكوين الدهون وسيولة على حركية الأنواع النشطة في الأغشية (على سبيل المثال، الببتيدات تشكيل المسام والبروتينات عبر الدهون37)،بما في ذلك الأغشية نموذج الثدييات والبكتيريا في درجة حرارة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية (37 درجة مئوية).

وفي هذه العبارة، سيتم شرح وصف لكيفية تجميع خزان نفط معدل من نوع DIB وتشغيل وحدة تحكم في درجة حرارة التغذية المرتدة لتمكين تجميع الطبقة الأحادية وتكوين طبقة ثنائية في درجات حرارة أعلى من RT. تتميز عن البروتوكول السابق40، يتم تضمين تفاصيل واضحة بشأن دمج الأجهزة اللازمة لقياس درجة الحرارة والتحكم فيها بالتوازي مع تجميع وتوصيف DIB في خزان النفط. وبالتالي فإن الإجراء سيمكن المستخدم من تطبيق هذه الطريقة لتشكيل ودراسة ثنائيات الفينيل متعددة التخصصات عبر مجموعة من درجات الحرارة في سياقات علمية متنوعة. وعلاوة على ذلك، تقدم النتائج التمثيلية أمثلة محددة لأنواع التغيرات القابلة للقياس في كل من هيكل الغشاء والنقل الأيوني التي يمكن أن تحدث مع تنوع درجة الحرارة. هذه التقنيات هي إضافات هامة للعديد من الدراسات الفيزيائية الحيوية التي يمكن تصميمها وتنفيذها بفعالية في DIBs ، بما في ذلك دراسة حركية الأنواع النشطة في الأغشية في تكوينات أغشية مختلفة.

Protocol

1. إعداد لاعبا اساسيا ساخنة جمع 2 قطعة من المطاط العازل 1 ملم سميكة قلصت إلى 25 ملم × 40 ملم في العرض والطول، على التوالي، 2 قطعة من المطاط 6 مم سميكة التي هي أيضا 25 ملم × 40 ملم، والتجمع قاعدة الألومنيوم جاهزة لاعبا اساسيا، وخزان النفط الاكريليك الذي يناسب في نافذة عرض لاعبا اساسيا قاعدة الأ…

Representative Results

يوضح الشكل 1 كيف يتم إعداد تجهيزات الألومنيوم وخزان زيت الأكريليك على مرحلة المجهر لتشكيل DIB. تعمل خطوات التجميع 1.2-1.4 على عزل المباراة حراريا عن المسرح للحصول على تدفئة أكثر كفاءة. تظهر الخطوات 1.5-1.7 كيفية إرفاق القسطرة الحرارية بشكل صحيح بالتركيبة ووضع خزان النفط، وتظهر ال?…

Discussion

يوفر البروتوكول الموصوف هنا تعليمات لتجميع وتشغيل نظام تجريبي للتحكم في درجة حرارة الزيت والقطرات المستخدمة لتشكيل DIBs. ومن المفيد بشكل خاص لتمكين تشكيل بنك الاستثمار الأوروبي باستخدام الدهون التي لديها ذوبان درجات الحرارة فوق RT. وعلاوة على ذلك، من خلال تغيير درجة حرارة خزان النفط بدقة، ?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم تقديم الدعم المالي من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم منحة CBET-1752197 ومكتب القوات الجوية للبحوث العلمية منحة FA9550-19-1-0213.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Keywords: Droplet Interface BilayerDIBTemperature-controlled AssemblyCharacterizationMembraneHeat TransferThermocoupleAluminum FixtureAcrylic ReservoirHexadecane OilInsulative RubberResistive Heating ElementsElectrical/optical CharacterizationTemperature-related EffectsCellular EnvironmentsTransport And Signaling PropertiesMembrane ConstituentsNatural Cellular Extracts
check_url/fr/62362?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citer Cet Article
Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
Télécharger la Citation
Réimpressions et Autorisations

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image