Analyse af Lipid sammensætning af mycobacteria af tyndt lag kromatografi
Summary
En protokol præsenteres for at udtrække det samlede lipidindhold i cellevæggen i en bred vifte af mykobakterier. Desuden er ekstraktion og analytiske protokoller af de forskellige typer mykolic syrer vist. En tynd-lag kromatografisk protokol til overvågning af disse mykobakterielle forbindelser er også forudsat.
Abstract
Mycobacteria arter kan afvige fra hinanden i vækstraten, tilstedeværelsen af pigmentering, koloni morfologi vises på faste medier, samt andre fænotypiske egenskaber. Men de har alle til fælles den mest relevante karakter af mycobacteria: dens unikke og meget hydrofobiske cellevæg. Mycobacteria arter indeholder en membran-kovalent forbundet kompleks, der omfatter arabinogalactan, peptidoglycan, og lange kæder af mykolic syrer med typer, der adskiller sig mellem mycobacteria arter. Derudover kan mycobacteria også producere lipider, der er placeret, ikke-kovalent forbundet, på deres celleoverflader, såsom phthiocerol dimycocerosates (PDIM), phenol glycolipider (PGL), glycopeptidolipids (GPL), acyltrehaloses (AT) eller fosphatidil-inositol mannosider (PIM), blandt andre. Nogle af dem betragtes virulensfaktorer i patogen mykobakteri eller kritiske antigene lipider i værts-mykobakterier interaktion. Af disse grunde er der en betydelig interesse i studiet af mykobakterielle lipider på grund af deres anvendelse på flere områder, fra at forstå deres rolle i patogeneligheden af mykobakterier til en mulig implikation som immunmodulerende midler til behandling af smitsomme sygdomme og andre patologier som kræft. Her præsenteres en simpel tilgang til at udtrække og analysere det samlede lipidindhold og mykolicsyresammensætningen af mykobakterier, der dyrkes i et solidt medium ved hjælp af blandinger af organiske opløsningsmidler. Når lipidekstrakterne er opnået, udføres tyndt lag kromatografi (TLC) for at overvåge de ekstraherede forbindelser. Eksemplet eksperiment udføres med fire forskellige mycobacteria: de miljømæssige hurtigt voksende Mycolicibacterium brumae og Mycolicibacterium fortuitum, den svækkede langsomt voksende Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin (BCG), og den opportunistiske patogen hurtigt voksende Mycobacterium byld, der viser, at metoder vist i den nuværende protokol kan bruges til en bred vifte af mycobacteria.
Introduction
Mycobacterium er en slægt, der omfatter patogene og ikke-patogene arter, karakteriseret ved at have en meget hydrofobisk og uigennemtrængelig cellevæg dannet af deres ejendommelige lipider. Specifikt indeholder mykobakterielle cellevæg mykolicsyrer, som er α-alkyl og β-hydroxy fedtsyrer, hvor α-grenen er konstant i alle mykolicsyrer (undtagen længden) og β-kæden, kaldet meromycolatekæden, er en lang alifatisk kæde, der kan indeholde forskellige funktionelle kemiske grupper beskrevet sammen med litteraturen (α-, α’-, methoxy-, κ-, epoxy-, carboxy-, og ω-1-methoxy-mykolater), derfor producerer syv typer mykossyrer (I-VII)1. Desuden er andre lipider med ubestridelig betydning også til stede i cellevæggen af mycobacteria arter. Patogene arter som f.eks. Mycobacterium tuberculosis, det forårsagende middel til tuberkulose2 producere specifikke lipidbaserede virulensfaktorer såsom phthiocerol dimycocerosater (PDIMs), phenol glycolipid (PGL), di-, tri-og penta-acyltrehaloses (DAT, TAT og PAT) eller sulfolipider, bl.a.3. Deres tilstedeværelse på den mykobakterielle overflade har været forbundet med evnen til at ændre værten immunrespons og derfor udviklingen og persistensen af mycobacterium inde i værten4. For eksempel har tilstedeværelsen af triacylglyceroler (TAG) været forbundet med hypervirulent fænotypen Lineage 2-Beijing underlinje af M. tuberculosis, muligvis på grund af dets evne til at svække værtsens immunrespons5,6. Andre relevante lipider er lipooligosaccharider (LOS’er), der er til stede i tuberkulose og ikke-jernholdige mykobakterier. I tilfælde af Mycobacterium marinum, er tilstedeværelsen af LOS’er i cellevæggen relateret til glidende motilitet og evnen til at danne biofilm og forstyrrer genkendelse af makrofagsmønstergenkendelsesreceptorer, der påvirker optagelsen og elimineringen af bakterierne ved værtsfocytter7,8. Derudover gør fraværet eller tilstedeværelsen af nogle lipider det muligt for medlemmer af samme art at blive klassificeret i forskellige morfotyper med virulent eller svækkede profiler, når de interagerer med værtsceller. F.eks. er fraværet af glycopeptidolipids (GPL) i den grove morphotype af Mycobacterium abscessus har været forbundet med evnen til at fremkalde intraphagosomal forsuring, og dermed celleapokaptose9, i modsætning til den glatte morphotype, der besidder GPLs i deres overflade. Desuden er lipidindholdet i mykobakterielle cellevæg relateret til evnen til at ændre immunresponset hos værten. Dette er relevant i forbindelse med brug af nogle mycobacteria til at udløse en beskyttende immunprofil mod forskellige patologier10,11,12,13. Det er f.eks. blevet påvist, at Mycolicibacterium vaccae, viser et saprofitisk mycobacterium, som i øjeblikket er i fase III kliniske forsøg som immunterapeutisk vaccine mod tuberkulose, to koloniale morfotyper. Mens den glatte fænotype, der indeholder en polyester i overfladen, udløser en Th2 svar, den ru fænotype blottet for polyester kan fremkalde en Th1 profil, når den interagerer med værtsimmunitetceller14. Repertoiret af lipider, der er til stede i mykobaktercellen, afhænger ikke kun af mykobakterier, men også af betingelserne for mykobakterielle kulturer: inkubationstid15,16 eller sammensætningen af kulturmediet17,18. Faktisk påvirker ændringer i kulturmediesammensætningen antitumor- og immunstimulerende aktivitet i M. bovis BCG og Mycolicibacterium brumae in vitro17. Desuden er den beskyttende immunprofil udløst af M. bovis BCG mod M. tuberculosis udfordring i musemodeller afhænger også af de kulturmedier, hvor M. bovis BCG vokser17. Disse kunne derefter være relateret til lipid sammensætning af mycobacteria i hver kultur tilstand. Af alle disse grunde er undersøgelsen af lipidindholdet i mykobakterier relevant. En visuel procedure til at udtrække og analysere lipidsammensætningen af den mykobakterielle cellevæg præsenteres.
Protocol
Representative Results
Discussion
En simpel protokol betragtes som guldstandardmetoden til udvinding af noncovalently linked lipidforbindelser fra mykobakterielle cellevæg præsenteres. Yderligere visualisering af en- og todimensionelle TLC’er fra de ekstraherede lipider af fire forskellige mykobakterier vises.
To på hinanden følgende kombinerede blandinger af chloroform og methanol til genfinding af lipidicindholdet i mykobakterielle celler er den mest udbredte opløsningsmiddelblanding23,</sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev finansieret af det spanske ministerium for videnskab, innovation og universiteter (RTI2018-098777-B-I00), FEDER-fondene og Generalitat of Catalunya (2017SGR-229). Sandra Guallar-Garrido modtager en ph.d.-kontrakt (FI) fra Generalitat de Catalunya.
Materials
| Acetic Acid | Merck | 100063 | CAUTION. Anhydrous for analysis EMSURE® ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Acetone | Carlo Erba | 400971N | CAUTION. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000 |
| Anthrone | Merck | 8014610010 | Anthrone for synthesis. |
| Benzene | Carlo Erba | 426113 | CAUTION. Benzene RPE – For analysis – ACS 2.5 l |
| Capillary glass tube | Merck | BR708709 | BRAND® disposable BLAUBRAND® micropipettes, intraMark |
| Chloroform | Carlo Erba | 412653 | CAUTION. Chloroform RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with ethanol 2.5 L |
| Dry block heater | J.P. Selecta | 7471200 | |
| Dicloromethane | Carlo Erba | 412622 | CAUTION. Dichloromethane RS – For HPLC – Isocratic grade – Stabilized with amylene 2.5 L |
| Diethyl ether | Carlo Erba | 412672 | CAUTION. Diethyl ether RS – For HPLC – Isocratic grade – Not stabilized 2.5 L |
| Ethyl Acetate | Panreac | 1313181211 | CAUTION. Ethyl acetate (Reag. USP, Ph. Eur.) for analysis, ACS, ISO |
| Ethyl Alcohol Absolute | Carlo Erba | 4146072 | CAUTION. Ethanol absolute anhydrous RPE – For analysis – ACS – Reag. Ph.Eur. – Reag. USP 1 L |
| Glass funnel | VidraFOC | DURA.2133148 1217/1 | |
| Glass tube | VidraFOC | VFOC.45066A-16125 | Glass tube with PTFE recovered cap |
| Methanol | Carlo Erba | 412722 | CAUTION. Methanol RS – For HPLC – GOLD – Ultragradient grade 2.5 L |
| Molybdatophosphoric acid hydrate | Merck | 51429-74-4 | CAUTION. |
| Molybdenum Blue Spray Reagent, 1.3% | Sigma | M1942-100ML | CAUTION. |
| n-hexane | Carlo Erba | 446903 | CAUTION. n-Hexane 99% RS – ATRASOL – For traces analysis 2.5 L |
| n-nitroso-n-methylurea | Sigma | N4766 | CAUTION |
| Orbital shaking platform | DDBiolab | 995018 | NB-205L benchtop shaking incubator |
| Petroleum ether (60-80ºC) | Carlo Erba | 427003 | CAUTION. Petroleum ether 60 – 80°C RPE – For analysis 2.5 L |
| Sprayer | VidraFOC | 712/1 | |
| Sodium sulphate anhydrous | Merck | 238597 | |
| Sulfuric acid 95-97% | Merck | 1007311000 | CAUTION. Sulfuric acid 95-97% |
| TLC chamber | Merck | Z204226-1EA | Rectangular TLC developing tanks, complete L × H × W 22 cm × 22 cm × 10 cm |
| TLC plate | Merck | 1057210001 | TLC SilicaGel 60- 20×20 cm x 25 u |
| TLC Plate Heater | CAMAG | 223306 | CAMAG TLC Plat Heater III |
| Toluene | Carlo Erba | 488551 | CAUTION. Toluene RPE – For analysis – ISO – ACS – Reag.Ph.Eur. – Reag.USP 1 L |
| Vortex | Fisher Scientific | 10132562 | IKA Agitador IKA vórtex 3 |
| 1-naphthol | Sigma-Aldrich | 102269427 | CAUTION. |
References
- Watanabe, M., et al. Location of functional groups in mycobacterial meromycolate chains; the recognition of new structural principles in mycolic acids. Microbiology. 148 (6), 1881-1902 (2002).
- Global Health Organization World Health Organization. (2018) Global tuberculosis report. WHO. , (2019).
- Jackson, M. The Mycobacterial cell envelope-lipids. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 4 (10), 1-36 (2014).
- Jankute, M., et al. The role of hydrophobicity in tuberculosis evolution and pathogenicity. Scientific Reports. 7 (1), 1315 (2017).
- Reed, M. B., Gagneux, S., DeRiemer, K., Small, P. M., Barry, C. E. The W-Beijing lineage of Mycobacterium tuberculosis overproduces triglycerides and has the DosR dormancy regulon constitutively upregulated. Journal of Bacteriology. 189 (7), 2583-2589 (2007).
- Ly, A., Liu, J. Mycobacterial virulence factors: Surface-exposed lipids and secreted proteins. International Journal of Molecular Sciences. 21 (11), 3985 (2020).
- Szulc-Kielbik, I., et al. Severe inhibition of lipooligosaccharide synthesis induces TLR2-dependent elimination of Mycobacterium marinum from THP1-derived macrophages. Microbial Cell Factories. 16 (1), 217 (2017).
- Ren, H., et al. Identification of the lipooligosaccharide biosynthetic gene cluster from Mycobacterium marinum. Molecular Microbiology. 63 (5), 1345-1359 (2007).
- Roux, A. L., et al. The distinct fate of smooth and rough Mycobacterium abscessus variants inside macrophages. Open Biology. 6 (11), 160185 (2016).
- Guallar-Garrido, S., Julián, E. Bacillus Calmette-Guérin (BCG) therapy for bladder cancer: An update. ImmunoTargets and Therapy. 9, 1-11 (2020).
- Bach-Griera, M., et al. Mycolicibacterium brumae is a safe and non-toxic immunomodulatory agent for cancer treatment. Vaccines. 8 (2), 2-17 (2020).
- Noguera-Ortega, E., et al. Nonpathogenic Mycobacterium brumae inhibits bladder cancer growth in vitro, ex vivo, and in vivo. European Urology Focus. 2 (1), 67-76 (2015).
- Noguera-Ortega, E., et al. Mycobacteria emulsified in olive oil-in-water trigger a robust immune response in bladder cancer treatment. Scientific Reports. 6, 27232 (2016).
- Rodríguez-Güell, E., et al. The production of a new extracellular putative long-chain saturated polyester by smooth variants of Mycobacterium vaccae interferes with Th1-cytokine production. Antonie van Leeuwenhoek. 90, 93-108 (2006).
- Garcia-Vilanova, A., Chan, J., Torrelles, J. B. Underestimated manipulative roles of Mycobacterium tuberculosis cell envelope glycolipids during infection. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
- Yang, L., et al. Changes in the major cell envelope components of Mycobacterium tuberculosis during in vitro growth. Glycobiology. 23 (8), 926-934 (2013).
- Guallar-Garrido, S., Campo-Pérez, V., Sánchez-Chardi, A., Luquin, M., Julián, E. Each mycobacterium requires a specific culture medium composition for triggering an optimized immunomodulatory and antitumoral effect. Microorganisms. 8 (5), 734 (2020).
- Venkataswamy, M. M., et al. et al. In vitro culture medium influences the vaccine efficacy of Mycobacterium bovis BCG. Vaccine. 30 (6), 1038-1049 (2012).
- Secanella-Fandos, S., Luquin, M., Pérez-Trujillo, M., Julián, E. Revisited mycolic acid pattern of Mycobacterium confluentis using thin-layer chromatography. Journal of Chromatography B. 879, 2821-2826 (2011).
- Minnikin, D. E., et al. Analysis of mycobacteria mycolic acids. Topics in Lipid Research: From Structural Elucidation to Biological Function. , 139-143 (1986).
- Minnikin, D. E., Hutchinson, I. G., Caldicott, A. B., Goodfellow, M. Thin-layer chromatography of methanolysates of mycolic acid-containing bacteria. Journal of Chromatography A. 188 (1), 221-233 (1980).
- Minnikin, D. E., Goodfellow, M. Lipid composition in the classification and identification of acid-fast bacteria. Society for Applied Bacteriology Symposium Series. 8, 189-256 (1980).
- Muñoz, M., et al. Occurrence of an antigenic triacyl trehalose in clinical isolates and reference strains of Mycobacterium tuberculosis. FEMS Microbiology Letters. 157 (2), 251-259 (1997).
- Daffé, M., Lacave, C., Lanéelle, M. A., Gillois, M., Lanéelle, G. Polyphthienoyl trehalose, glycolipids specific for virulent strains of the tubercle bacillus. European Journal of Biochemistry. 172 (3), 579-584 (1988).
- Singh, P., et al. Revisiting a protocol for extraction of mycobacterial lipids. International Journal of Mycobacteriology. 3 (3), 168-172 (2014).
- Camacho, L. R., et al. Analysis of the phthiocerol dimycocerosate locus of Mycobacterium tuberculosis. Evidence that this lipid is involved in the cell wall permeability barrier. Journal of Biological Chemistry. 276 (23), 19845-19854 (2001).
- Dhariwal, K. R., Chander, A., Venkitasubramanian, T. A. Alterations in lipid constituents during growth of Mycobacterium smegmatis CDC 46 and Mycobacterium phlei ATCC 354. Microbios. 16 (65-66), 169-182 (1976).
- Chandramouli, V., Venkitasubramanian, T. A. Effect of age on the lipids of mycobacteria. Indian Journal of Chest Diseases & Allied Sciences. 16, 199-207 (1982).
- Hameed, S., Sharma, S., Fatima, Z. Techniques to understand mycobacterial lipids and use of lipid-based nanoformulations for tuberculosis management. NanoBioMedicine. , (2020).
- Folch, J., Lees, M., Sloane Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. The Journal of Biological Chemistry. 226 (1), 497-509 (1957).
- Pal, R., Hameed, S., Kumar, P., Singh, S., Fatima, Z. Comparative lipidome profile of sensitive and resistant Mycobacterium tuberculosis strain. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 1 (1), 189-197 (2015).
- Slayden, R. A., Barry, C. E. Analysis of the lipids of Mycobacterium tuberculosis. Mycobacterium tuberculosis Protocols. 54, 229-245 (2001).
- Ojha, A. K., et al. Growth of Mycobacterium tuberculosis biofilms containing free mycolic acids and harbouring drug-tolerant bacteria. Molecular Microbiology. 69 (1), 164-174 (2008).
- Ojha, A. K., Trivelli, X., Guerardel, Y., Kremer, L., Hatfull, G. F. Enzymatic hydrolysis of trehalose dimycolate releases free mycolic acids during mycobacterial growth in biofilms. The Journal of Biological Chemistry. 285 (23), 17380-17389 (2010).
- Layre, E., et al. Mycolic acids constitute a scaffold for mycobacterial lipid antigens stimulating CD1-restricted T cells. Chemistry and Biology. 16 (1), 82-92 (2009).
- Llorens-Fons, M., et al. Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence. Frontiers in Microbiology. 8, (2017).
- Butler, W. R., Guthertz, L. S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species. Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).
- Teramoto, K., et al. Characterization of mycolic acids in total fatty acid methyl ester fractions from Mycobacterium species by high resolution MALDI-TOFMS. Mass Spectrometry. 4 (1), 0035 (2015).
- Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel “Mtb LipidDB”. Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).
- Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).
- Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species. International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670 (2020).
