Analyse quantitative de la dynamique des bords cellulaires pendant la propagation cellulaire
Summary
Dans ce protocole, nous présentons les procédures expérimentales d’un essai de propagation cellulaire qui est basé sur la microscopie à cellules vivantes. Nous fournissons un outil de calcul open-source pour la segmentation impartiale des cellules étiquetées fluorescentement et l’analyse quantitative de la dynamique de lamellipodia pendant la propagation cellulaire.
Abstract
La propagation cellulaire est un processus dynamique dans lequel une cellule suspendue dans le corps se fixe à un substrat et s’aplatit d’une forme arrondie à une forme mince et étalée. Après l’attachement cellule-substrat, la cellule forme une mince feuille de lamellipodie émanant du corps cellulaire. Dans la lamellipodie, les monomères globulaires d’actine (G-actin) polymérisent dans un maillage filamenteux dense d’actine (F-actin) qui pousse contre la membrane plasmatique, fournissant ainsi les forces mécaniques nécessaires à la propagation de la cellule. Notamment, les acteurs moléculaires qui contrôlent la polymérisation de l’actine dans la lamellipodie sont essentiels pour de nombreux autres processus cellulaires, tels que la migration cellulaire et l’endocytose.
Depuis que les cellules qui se propagent forment une lamellipodie continue qui s’étend sur toute la périphérie cellulaire et se dilatent constamment vers l’extérieur, les analyses de propagation cellulaire sont devenues un outil efficace pour évaluer la cinétique des saillies lamellipodial. Bien que plusieurs implémentations techniques de l’analyse de propagation cellulaire aient été développées, il manque actuellement une description détaillée du flux de travail, qui comprendrait à la fois un protocole étape par étape et des outils informatiques pour l’analyse des données. Ici, nous décrivons les procédures expérimentales de l’analyse de propagation cellulaire et présentons un outil open-source pour l’analyse quantitative et impartiale de la dynamique du bord cellulaire lors de la propagation. Lorsqu’il est combiné avec des manipulations pharmacologiques et / ou des techniques de silencing des gènes, ce protocole est approprié à un écran à grande échelle des acteurs moléculaires régulant les saillies lamellipodial.
Introduction
Les saillies lamellipodial sont des structures cytosquelettiques proéminentes formées à l’avant d’une cellule migrante. Dans la lamellipodia, la polymérisation de l’actine à l’aide du complexe Arp2/3 et des formins crée un maillage d’actine ram ramifère à croissance rapide qui pousse contre la membraneplasmatique 1,2. La force de poussée générée par le maillage actin propulse physiquement la cellule versl’avant 1,3,4,5. L’épuisement du complexe Arp2/3 ou la perturbation des voies de signalisation essentielles aux saillies lamellipodiales nuisent souvent à la migration cellulaire6, 7. Bien que la migration des cellules lamellipodia-déficientes ait égalementété rapportée 8,9,l’importance de la lamellipodia dans la migration cellulaire est évidente car l’épuisement de cette structure saillante perturbe la capacité de la cellule à se déplacer par des microenvironnements biologiquescomplexes 6,10.
Un obstacle majeur à la compréhension de la régulation de la lamellipodia dans les cellules migration est la variabilité naturelle de la cinétique de saillie lamellipodial, la taille et la forme11,12,13,14. En outre, des études récentes ont démontré que la lamellipodia présentent des comportements complexes saillants, y compris fluctuants, périodiques et accélérant les saillies14,15. Par rapport à la lamellipodie très variable des cellules migratives6,16, lamellipodie formée pendant la propagation cellulaire sont plusuniformes 12. Depuis l’activité saillante de la propagation et la migration des cellules est entraînée par des assemblages macromoléculaires identiques, qui comprennent un réseau d’actine ram ramée, faisceaux d’actomyosine contractile, et à base d’intégrine adhérencescellulaires matrice 17,18, cellules de propagation ont été largement utilisés comme un modèle pour étudier la régulation de la dynamique lamellipodia.
La propagation cellulaire est un processus mécanochimique dynamique où une cellule en suspension adhère d’abord à un substrat par des adhérences à base d’intégrine17,19,20, puis se propage en étendant les saillies à base d’actine21,22,23. Pendant la phase de propagation, la lamellipodia émanant du corps cellulaire dépasse isotropiquement et constamment avec peu ou pas de rétractation oud’étalon 12. Les protocoles de propagation cellulaire les plus couramment utilisés sont les analyses de points de terminaison, où les cellules de propagation sont fixées à divers moments aprèsle placage 19,24. Ces analyses, bien que rapides et simples, sont limitées dans leur puissance diagnostique pour détecter des changements dans les dispositifs dynamiques de lamellipodia. Pour déterminer les mécanismes moléculaires qui contrôlent la dynamique de la lamellipodia, le groupe sheetz a été le pionnier de l’utilisation de l’analyse quantitative des cellules vivantes de propagation et a découvert de nombreuses propriétés fondamentales des saillies de bord cellulaire11,12,22. Ces études ont démontré que l’essai de propagation des cellules vivantes est une technique robuste et puissante dans la boîte à outils d’un laboratoire de biologie cellulaire. Malgré cela, un protocole détaillé et un outil de calcul open-source pour un test de propagation des cellules vivantes ne sont actuellement pas disponibles pour la communauté de biologie cellulaire. À cette fin, notre protocole décrit les procédures d’imagerie des cellules de propagation en direct et fournit un outil automatisé d’analyse d’image. Pour valider cette méthode, nous avons utilisé l’inhibition arp2/3 comme traitement expérimental et avons montré que l’inhibition de la fonction du complexe Arp2/3 n’arrêtait pas la propagation cellulaire, mais causait une réduction significative de la vitesse de saillie cellulaire, ainsi que la stabilité des saillies du bord cellulaire, donnant lieu à des bords de cellules déchiquetés. Ces données démontrent que la combinaison de l’imagerie à cellules vivantes et de l’analyse automatisée de l’image est un outil utile pour analyser la dynamique des bords cellulaires et identifier les composants moléculaires qui régulent la lamellipodie.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’analyse de propagation cellulaire décrite permet le suivi continu des changements morphologiques(p. ex., taille et forme des cellules) et des mouvements des bords cellulaires(c.-à-d. vitesse de saillie et fréquence de rétractation), qui sont des caractéristiques manquantes dans la plupart des protocoles depropagation cellulaire 19,24. Bien que les analyses de propagation cellulaires à point final couramment utilisées permettent de dé…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ces travaux ont été appuyés par le Prix du nouvel enquêteur du Fonds Connaught à S.P., la Fondation canadienne pour l’innovation, le Programme de subventions à la découverte du CSERN (subventions RGPIN-2015-05114 et RGPIN-2020-05881), le Fonds conjoint de recherche de l’Université de Manchester et de l’Université de Toronto et le Programme XSeed de l’Université de Toronto.
Materials
| 0.05% Trypsin (0.05%), 0.53 mM EDTA | Wisent Bioproducts | 325-042-CL | |
| 10.0 cm Petri Dish, Polystyrene, TC Treated, Vented | Starstedt | 83.3902 | |
| 15 mL High Clarity PP Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile | Falcon | 352097 | |
| 1-Well Chamlide CMS for 22 mm x 22 mm Coverslip | Quorum Technologies | CM-S22-1 | |
| 35 mm TC-treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish | Falcon | 353001 | |
| 50 mL Centrifuge Tube, Transparent, Plug Seal | Nest | 602002 | |
| 6.0 cm Cell Culture Dishes Treated for Increased Cell Attachment, Sterile | VWR | 10861-658 | |
| Arp2/3 Complex Inhibitor I, CK-666 | Millipore Sigma | 182515 | |
| Camera, Prime 95B-25MM | Photometrics | ||
| Dimethyl Sulfoxide, Sterile | BioShop | DMS666 | |
| DMEM, 1x, 4.5 g/L Glucose, with L-Glutamine, Sodium Pyruvate and Phenol Red | Wisent Bioproducts | 319-005 CL | |
| DMEM/F-12, HEPES, No Phenol Red | Gibco | 11039021 | |
| D-PBS, 1X | Wisent Bioproducts | 311-425 CL | |
| Fetal Bovine Serum | Wisent Bioproducts | 080-110 | |
| Fiji Software | ImageJ | ||
| HEPES (1 M) | Gibco | 15630080 | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein 1 mg | Millipore Sigma | FC010 | |
| Immersion Oil | Cargille | 16241 | |
| L-Glutamine Solution (200 mM) | Wisent Bioproducts | 609-065-EL | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140050 | |
| Micro Cover Glasses, Square, No. 11/2 22 x 22 mm | VWR | CA48366-227-1 | |
| Microscope Body, Eclipse Ti2-E | Nikon | ||
| Objective, CFI Plan Apo Lambda 60X Oil | Nikon | MRD01605 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Spinning Disk, Crest Light V2 | CrestOptics | ||
| Spyder | Anaconda | ||
| Stage top incubator | Tokai Hit | ||
| Statistics Software, Prism | GraphPad | ||
| Tweezers, Style 2 | Electron Microscopy Sciences | 78326-42 |
References
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