Summary

अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी के साथ प्रोसेसिव मायोसिन के मेकानोएनजाइमेटिक गुणों का विच्छेदन

Published: July 01, 2021
doi:

Summary

यहां प्रस्तुत प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोगों को करने के लिए एक व्यापक प्रोटोकॉल है, जिसे आसानी से प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से लेकर नमूना तैयार करने, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण तक सभी आवश्यक चरणों का विवरण देता है।

Abstract

अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूएफएफसीएस) लेजर ट्वीज़र्स पर आधारित एक एकल अणु तकनीक है जो अभूतपूर्व समय संकल्प के साथ लोड के तहत पारंपरिक और अपरंपरागत मायोसिन दोनों के केमोमैकेनिक्स की जांच की अनुमति देती है। विशेष रूप से, एक्टिन-मायोसिन बॉन्ड गठन के ठीक बाद निरंतर बल के तहत मायोसिन मोटर्स की जांच करने की संभावना, बल प्रतिक्रिया (200 kHz) की उच्च दर के साथ, यूएफसी को मायोसिन वर्किंग स्ट्रोक जैसे तेज गतिशीलता की भार निर्भरता का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण दिखाया गया है। इसके अलावा, यूएफएफसीएस इस अध्ययन को सक्षम बनाता है कि कैसे प्रक्रियात्मक और गैर-प्रक्रियात्मक मायोसिन-एक्टिन इंटरैक्शन लागू बल की तीव्रता और दिशा से प्रभावित होते हैं।

इस प्रोटोकॉल का पालन करके, प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 मोटर्स और विभिन्न प्रकार के अपरंपरागत मायोसिन पर अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप प्रयोग करना संभव होगा। कुछ समायोजनों द्वारा, प्रोटोकॉल को आसानी से किन्सिन और डायनिन जैसे प्रक्रियात्मक मोटर्स के अन्य वर्गों के अध्ययन के लिए भी बढ़ाया जा सकता है। प्रोटोकॉल में प्रयोगात्मक उपकरण के सेटअप से लेकर नमूना तैयार करने, अंशांकन प्रक्रियाओं, डेटा अधिग्रहण और विश्लेषण तक सभी आवश्यक कदम शामिल हैं।

Introduction

पिछले दशकों में ऑप्टिकल चिमटी एकल अणु स्तर पर प्रोटीन इंटरैक्शन के मेकेनोकेमिस्ट्री को स्पष्ट करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण रहा है, समवर्ती हेरफेर और संवहन परिवर्तनों और एंजाइमेटिक कैनेटीक्स 1,2 के माप की हड़ताली संभावना के कारण। विशेष रूप से, सेल में आणविक मोटर्स द्वारा लगाए गए बलों की सीमा में बलों को लागू करने और मापने की क्षमता, साथ ही उप-नैनोमीटर संवहन परिवर्तनों को मापने की क्षमता ने ऑप्टिकल ट्वीज़र्स को मोटर प्रोटीन के केमोमेकैनिकल गुणों और उनके यांत्रिक विनियमन को उजागर करने के लिए एक अद्वितीय एकल-अणु उपकरण बना दिया।

अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी (यूएफएफसीएस) ऑप्टिकल ट्वीज़र्स पर आधारित एक एकल-अणु बल-स्पेक्ट्रोस्कोपी तकनीक है, जिसे तीन-मोती ज्यामिति (चित्रा 1 ए) 3,4 में लोड के तहत आणविक मोटर्स के तेज कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए विकसित किया गया है। यूएफएफसीएस मोटर प्रोटीन के लिए बल आवेदन के लिए समय अंतराल को ऑप्टिकल ट्वीज़र्स की भौतिक सीमा तक कम कर देता है, यानी, सिस्टम का यांत्रिक विश्राम समय, इस प्रकार मायोसिन रन (कुछ दसियों माइक्रोसेकंड) की शुरुआत के बाद बल के आवेदन को तेजी से अनुमति देता है। इस क्षमता का उपयोग तेजी से कंकाल 3 और कार्डियक5 मांसपेशी मायोसिन में प्रारंभिक यांत्रिक घटनाओं की जांच करने के लिए किया गया है ताकि पावरस्ट्रोक, कमजोर और मजबूत-बाध्यकारी अवस्थाओं की भार निर्भरता को प्रकट किया जा सके, साथ ही जैव रासायनिक (पीआई) और यांत्रिक (पावरस्ट्रोक) घटनाओं का क्रम भी प्रकट किया जा सके।

तीन-मोती ज्यामिति को आमतौर पर गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स का अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जाता है, बल-क्लैंप के साथ एक एकल मोती ज्यामिति का उपयोग आमतौर पर मायोसिन वीए 6 जैसे प्रक्रियात्मक गैर-पारंपरिक मायोसिनकी जांच के लिए किया जाता है। हालांकि, प्रक्रियात्मक मायोसिन के लिए तीन-बीड्स यूएफआईसीएस परख को प्राथमिकता देने के कई कारण हैं। सबसे पहले, एक्टिन-मायोसिन बाइंडिंग के ठीक बाद लोड का तेजी से आवेदन गैर-प्रक्रियात्मक मोटर्स के रूप में बल विकास में शुरुआती घटनाओं के माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, प्रोसेसिव मोटर्स के मामले में यह मोटर की रन लंबाई और उनकी प्रगति के माध्यम से निरंतर बल के तहत चलने की अवधि का सटीक माप भी देता है (चित्रा 1 बी)। इसके अलावा, बल प्रतिक्रिया की उच्च दर के कारण, सिस्टम स्थिति में तेजी से बदलाव के दौरान बल स्थिर रख सकता है, जैसे कि मायोसिन वर्किंग स्ट्रोक, जिससे मोटर स्टेपिंग के दौरान निरंतर भार की गारंटी मिलती है। सिस्टम का उच्च-अस्थायी रिज़ॉल्यूशन उप-एमएस इंटरैक्शन का पता लगाने की अनुमति देता है, जिससे एक्टिन के लिए मायोसिन के कमजोर बंधन की जांच की संभावना खुल जाती है। अंत में, परख ज्यामिति गारंटी देती है कि बल को एक्टिन फिलामेंट के साथ लागू किया जाता है, जिसमें बल के नगण्य अनुप्रस्थ और ऊर्ध्वाधर घटक होते हैं। यह बिंदु विशेष रूप से प्रासंगिक है क्योंकि ऊर्ध्वाधर बल घटक को मोटर के कैनेटीक्स 7,8 की लोड-निर्भरता को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करने के लिए दिखाया गया है। इस तकनीक का उपयोग करके, हम प्रक्रियात्मक मायोसिन -5 बी के लिए सहायक और प्रतिरोधक भार की एक श्रृंखला लागू कर सकते हैं औरसीधे बलों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इसकी प्रक्रिया की भार निर्भरता को माप सकते हैं।

जैसा कि चित्रा 1 ए में दिखाया गया है, इस प्रणाली में एक एकल एक्टिन फिलामेंट डबल ऑप्टिकल ट्वीज़र्स (“डंबल”) के फोकस में फंसे दो पॉलीस्टाइनिन मोतियों के बीच निलंबित हो जाता है। एक असंतुलित शुद्ध बल F = F1-F2 को फिलामेंट पर एक तेज प्रतिक्रिया प्रणाली के माध्यम से लगाया जाता है, जो फिलामेंट को एक दिशा में निरंतर वेग से तब तक चलता है जब तक कि यह उपयोगकर्ता-परिभाषित व्युत्क्रम बिंदु तक नहीं पहुंच जाता है जहां शुद्ध बल विपरीत दिशा में उलट हो जाता है। जब मोटर प्रोटीन फिलामेंट के साथ बातचीत नहीं कर रहा होता है, तो डंबल एक त्रिकोणीय तरंग आकार (चित्रा 1 बी, नीचे पैनल) में आगे और पीछे जाने के लिए स्वतंत्र होता है, जो पेडस्टल मोती को फैलाता है जिस पर एक एकल मोटर प्रोटीन जुड़ा होता है। एक बार बातचीत स्थापित हो जाने के बाद डंबल द्वारा ले जाया जाने वाला बल बहुत तेजी से मोटर प्रोटीन में स्थानांतरित हो जाता है और मोटर बातचीत के समय प्रतिक्रिया प्रणाली द्वारा लागू बल तीव्रता और दिशा के तहत कदम रखकर फिलामेंट को विस्थापित करना शुरू कर देता है, जब तक कि मायोसिन एक्टिन से अलग नहीं हो जाता। फंसे हुए एक्टिन फिलामेंट की ध्रुवीयता पर निर्भर मोटर के कदम से उत्पन्न विस्थापन होने के नाते, लागू बल की दिशा के अनुसार भार या तो सहायक हो सकता है, यानी, मोटर विस्थापन की एक ही दिशा में धक्का देना (चित्रा 1 बी ऊपरी पैनल में धक्का), या प्रतिरोधक, यानी, मोटर विस्थापन के संबंध में विपरीत दिशा में खींचना (चित्रा 1 बी में खींचना) ऊपरी पैनल) लागू भार की तीव्रता और दिशात्मकता दोनों द्वारा मोटर प्रक्रिया के केमोमैकेनिकल विनियमन का अध्ययन करना संभव बनाता है।

अगले खंडों में अल्ट्राफास्ट फोर्स-क्लैंप स्पेक्ट्रोस्कोपी सेटअप के साथ विभिन्न भार के तहत एक्टिन-मायोसिन -5 बी इंटरैक्शन को मापने के लिए सभी चरणों का पूरी तरह से वर्णन किया गया है, जिसमें 1) ऑप्टिकल सेटअप की स्थापना, ऑप्टिकल ट्रैप संरेखण और अंशांकन प्रक्रियाएं, 2) नमूना कक्ष में सभी घटकों और उनकी असेंबली की तैयारी, 3) माप प्रक्रिया, 4) महत्वपूर्ण भौतिक मापदंडों को निकालने के लिए प्रतिनिधि डेटा और डेटा विश्लेषण, जैसे रन की लंबाई, चरण आकार और मोटर प्रोटीन का वेग।

Protocol

1. ऑप्टिकल सेटअप नोट: प्रायोगिक सेटअप नैनोमीटर पॉइंटिंग स्थिरता और 1% लेजर तीव्रता में उतार-चढ़ाव के < डबल ऑप्टिकल ट्वीज़र्स से बना है। इन स्थितियों के तहत, नैनोमीटर स्तर पर डंबल की स्थिरता को व?…

Representative Results

प्रतिनिधि डेटा समय के साथ स्थिति रिकॉर्ड में शामिल होता है जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है। स्थिति रिकॉर्ड में दो प्रकार के विस्थापन दिखाई देते हैं। सबसे पहले, जब मायोसिन मोटर एक्टिन फिला…

Discussion

यद्यपि एकल अणु तकनीक, जैसे कि तीन-मोती परख, तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण और कम थ्रूपुट हैं, यूएफएफसीएस डेटा के उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात के लिए आणविक इंटरैक्शन का पता लगाने में सुधार करता है। यूएफएफसीएस मो…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस काम को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम द्वारा अनुदान समझौते संख्या 871124 लेजरलैब-यूरोप के तहत, इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (एफआईआरबी “फ्यूचरो इन राइसर्का” 2013 ग्रांट नंबर आरबीएफआर 13 वी 4 एम 2) और एंटे कसा डी रिस्पार्मियो डी फायरेंज़ द्वारा समर्थित किया गया था। ए.वी. काशचुक को ह्यूमन फ्रंटियर साइंस प्रोग्राम क्रॉस-डिसिप्लिनरी फैलोशिप एलटी008/2020-सी द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

 Aliphatic Amine Latex Beads ThermoFisher A37362 1.0-μm diameter, 2% (w/v)
Acetone Sigma 32201
Actin polymerization buffer Cytoskeleton BSA02 10X
AODs (acousto-optic deflectors) AA Opto Electronic DTS-XY 250 Laser beam deflectors
ATP Sigma A7699
Biotinylated-BSA ThermoFisher 29130
BSA Sigma B4287
Calmodulin from porcine brain (CaM) Merck Millipore 208783
Catalase from bovine liver Sigma C40
Condenser Olympus OlympusU-AAC, Aplanat, Achromat NA 1.4, oil immersion
Creatine phosphate disodium salt tetrahydrate Sigma 27920
Creatine Phosphokinase from rabbit muscle Sigma C3755
DDs AA Opto Electronic AA.DDS.XX Two-channel digital synthesizer
DL-Dithiothreitol (DTT)/td> Sigma 43819
EGTA Sigma E4378
G-actin protein Cytoskeleton AKL99
Glucose Sigma G7528
Glucose Oxidase from Aspergillus niger Sigma  G7141
HaloTag succinimidyl ester O2 ligand Promega P1691
High vacuum silicone grease heavy Merck Millipore 107921
KCl Sigma P9541
KH2PO4/K2HPO4 Sigma P5379/ P8281
Labview National Instruments version 8.1 Data acquisition
Labview FPGA module National Instruments version 8.1 Fast Force-Clamp
Matlab MathWorks 2016 Data analysis
MgCl2 Fluka 63020
Microscope Objective Nikon Plan-Apo 60X NA 1.2, WD 0.2 mm, water imm.
MOPS Sigma M1254
Nitrocellulose Sigma N8267 0.45 pore size
Pentyl acetate solution Sigma 46022
Pure Ethanol  Sigma 2860
QPDs UDT DLS-20 D Position Detecto
Rhodamine BSA Molecular Probes A23016
Rhodamine Phalloidin  Sigma P1951
Silica beads Bangslabs SS04N 1.21 mm, 10% solids
Sodium azide  Sigma S2002
Streptavidin protein  Sigma 189730

References

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Citer Cet Article
Gardini, L., Kashchuk, A. V., Pavone, F. S., Capitanio, M. Dissecting Mechanoenzymatic Properties of Processive Myosins with Ultrafast Force-Clamp Spectroscopy. J. Vis. Exp. (173), e62388, doi:10.3791/62388 (2021).

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