Récolte et désagrégation : une étape négligée dans la recherche sur les méthodes de biofilm
Summary
Cet article détaille les méthodes qui démontrent trois techniques courantes de récolte et de désagrégation du biofilm sur deux types de surface, les tests de robustesse d’une méthode de récolte et les informations minimales à prendre en compte lors du choix et de l’optimisation des techniques de récolte et de désagrégation pour augmenter la reproductibilité.
Abstract
Les méthodes de biofilm se composent de quatre étapes distinctes: cultiver le biofilm dans un modèle pertinent, traiter le biofilm mature, récolter le biofilm de la surface et désagréger les amas, et analyser l’échantillon. Des quatre étapes, la récolte et la désagrégation sont les moins étudiées, mais néanmoins essentielles lorsqu’on considère le potentiel de biais des tests. Cet article présente les techniques de récolte et de désagrégation couramment utilisées pour le biofilm cultivé sur trois surfaces différentes. Les trois techniques de récolte et de désagrégation du biofilm, glanées dans une vaste revue de la littérature, comprennent le vortex et la sonication, le grattage et l’homogénéisation, ainsi que le grattage, le vortex et la sonication. Deux types de surface sont considérés: dur non poreux (polycarbonate et verre borosilicate) et poreux (silicone). De plus, nous fournissons des recommandations pour les informations minimales qui devraient être incluses lors de la déclaration de la technique de récolte suivie et une méthode d’accompagnement pour vérifier les biais.
Introduction
La définition du biofilm a évolué au cours des dernières décennies et englobe l’association microbienne avec une variété de surfaces biologiques et/ou non biologiques, l’inclusion de composants non cellulaires1 qui présentent une croissance et une expression génétique différentes2 au sein d’une matrice. Le biofilm offre une protection contre les stress environnementaux tels que le séchage et peut rendre l’action des désinfectants chimiques moins efficace, ce qui entraîne la survie des microbes. Les survivants d’un biofilm peuvent potentiellement fournir une source de micro-organismes pathogènes qui constituent un problème de santé publique3.
Les méthodes de biofilm comprennent quatre étapes, la croissance, le traitement, l’échantillonnage (récolte et désagrégation) et l’analyse. La croissance, la première étape, où l’utilisateur détermine les conditions de croissance de l’organisme, la température, le milieu, etc., est la plus considérée et rapportée dans la littérature sur les biofilms4,5,6,7. L’étape du traitement évalue les antimicrobiens (p. ex. les désinfectants) afin de déterminer leur efficacité soit par rapport à un biofilm mature3,8,9, soit par l’antimicrobien qui peut être incorporé dans la surface pour déterminer la capacité du produit à prévenir ou à réduire la croissance du biofilm10. La troisième étape, l’échantillonnage, comprend des étapes pour récolter le biofilm de la surface sur laquelle il poussait et pour désagréger les touffes enlevées3,8,11. La quatrième étape, l’analyse, peut inclure le comptage de cellules viables, la microscopie, les mesures de fluorescence, les résultats moléculaires et/ou une évaluation des composants matriciels8,9. L’évaluation des données fournit des informations sur les résultats d’une expérience. Des quatre, l’échantillonnage est souvent l’étape la plus négligée car elle suppose que la technique de récolte et/ou de désagrégation du biofilm choisie est efficace à 100 %, souvent sans vérification11.
Les suspensions planctoniques de bactéries, souvent considérées comme homogènes, nécessitent un simple vortex avant l’analyse. Les biofilms, cependant, sont des communautés complexes composées de micro-organismes (procaryotes et/ou eucaryotes), d’exopolysaccharides, de protéines, de lipides, d’ADN extracellulaire et de cellules hôtes12. Des étapes au-delà des méthodes traditionnelles de culture microbiologique planctonique sont nécessaires pour récolter adéquatement le biofilm d’une surface, puis le désagréger en une suspension homogène à cellule unique. Une analyse approfondie de la littérature (informations non incluses dans cette publication) a démontré que le choix de la technique d’élimination et de désagrégation dépend d’un certain nombre de facteurs, notamment les espèces présentes dans le biofilm, la surface à laquelle le biofilm est attaché (non poreux ou poreux), l’accessibilité aux surfaces de croissance (coupon facilement amovible ou destruction physique de l’appareil dans lequel le biofilm se développe), la géométrie de surface (surface et forme), la densité du biofilm sur les surfaces de croissance et l’équipement de laboratoire disponible.
Lorsque le biofilm est récolté à partir d’une surface, la suspension cellulaire résultante est hétérogène. Si cette suspension non uniforme doit être énumérée avec précision, elle doit être désagrégée en cellules individuelles. Les comptages sur plaque viables supposent qu’une unité formant une colonie provient d’une bactérie. Si des agrégats de biofilm sont placés sur le milieu de croissance, il est impossible de distinguer les cellules individuelles, ce qui pourrait conduire à des estimations inexactes. Par exemple, lors des tests d’efficacité du désinfectant, si un traitement élimine très efficacement le biofilm d’une surface par rapport au témoin, la réduction logarithmique pourrait sembler artificiellement importante par rapport au témoin. D’autre part, un désinfectant chimique qui fixe le biofilm sur une surface par rapport au témoin semblera avoir une réduction logarithmique plus faible11. Ce type de scénario pourrait conduire à une interprétation biaisée des données expérimentales.
En préparation de la publication, une revue de la littérature a déterminé que les approches courantes de la récolte et du désagrégage du biofilm comprennent le grattage, l’écouvillonnage, la sonication, le vortex ou une combinaison de ceux-ci. Le grattage est défini comme l’élimination physique du biofilm des surfaces à l’aide d’un bâton stérile, d’une spatule ou d’un autre outil. L’écouvillonnage fait référence à l’élimination du biofilm des surfaces avec un bâton à pointe de coton ou un autre matériau absorbant fixe. La sonication fait référence à la perturbation du biofilm des surfaces par des ondes ultrasonores distribuées dans l’eau. Le vortex fait référence à l’utilisation d’un mélangeur pour obtenir un vortex liquide de l’échantillon à l’intérieur d’un tube. L’homogénéisation utilise des lames rotatives pour cisailler les amas de biofilm récoltés en une suspension à cellule unique. Dans cet article, nous présentons trois méthodes de récolte et de désagrégation pour deux types de surface différents, dur/non poreux et poreux.
Une liste des renseignements minimaux recommandés que les chercheurs devraient inclure dans les sections sur les méthodes des publications est fournie. Nous espérons que l’inclusion de ces informations permettra à d’autres chercheurs de reproduire leurs travaux. Il n’y a pas de méthode parfaite de récolte et de désagrégation, par conséquent, des recommandations sur la façon de vérifier la technique sont également fournies.
Trois méthodes courantes pour récolter et désagréger le biofilm à partir de surfaces de croissance communes sont démontrées dans cet article. Cette information permettra aux chercheurs de mieux comprendre la précision globale et le biais d’une méthode d’essai de biofilm. Les méthodes décrites sont les suivantes: (1) Un biofilm de Pseudomonas aeruginosa cultivé sur des coupons en polycarbonate (surface dure non poreuse) sous cisaillement fluide élevé dans le réacteur à biofilm CDC est récolté et désagrégé après une combinaison en cinq étapes de vortex et de sonication pour obtenir la récolte et la désagrégation du biofilm (2) A P. aeruginosa le biofilm cultivé sur des coupons de verre borosilicate (surface dure non poreuse) dans le réacteur à écoulement goutte à goutte sous faible cisaillement fluide est récolté et désagrégé par grattage et homogénéisation (3) Un biofilm d’Escherichia coli cultivé dans des tubes en silicone (surface poreuse) est récolté et désagrégé par grattage, suivi d’une sonication et d’un vortex.
Protocol
Representative Results
Discussion
Informations minimales pour les méthodes de récolte et de désagrégation
Pour créer des données reproductibles sur les biofilms dans l’ensemble de la communauté scientifique, il est impératif que les auteurs incluent autant de détails que possible concernant chacune des étapes de croissance, de traitement, d’échantillonnage et d’analyse d’une méthode de biofilm. La normalisation des méthodes de biofilm a aidé dans cette entreprise car elle permet au chercheur de référencer une m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Danielle Orr Goveia, Blaine Fritz, Jennifer Summers et Fei San Lee pour leurs contributions à ce document.
Materials
| 50 mL conical vials | Thermo Scientific | 339652 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific | FB102100 | |
| 5 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-12D | For adding treatment to vials containing coupons. |
| 50 mL serological pipettes | Fisher Scientific | 13-678-14C | For adding neutralizer to vials at the end of treatment contact time. |
| Applicator sticks | Puritan | 807 | |
| Hemostats | Fisher Scientific | 16-100-115 | |
| Metal spatula | Fisher Scientific | 14-373 | |
| PTFE policemen | Saint-Gobain | 06369-04 | |
| S 10 N – 10 G – ST Dispersing tool | IKA | 4446700 | For homogenization of biofilm samples. |
| Scissors | Fisher Scientific | 08-951-20 | |
| Silicone Foley catheter, size 16 French | Medline Industries | DYND11502 | |
| Silicone tubing, size 16 | Cole-Parmer | EW96400-16 | |
| Splash Guards | BioSurface Technologies, Inc. | CBR 2232 | |
| T 10 basic ULTRA-TURRAX Disperser | IKA | 3737001 | For homogenization of biofilm samples. |
| Tubing connectors | Cole-Parmer | EW02023-86 | |
| Ultrasonic Cleaner | Elma | TI-H15 | |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Vortex-Genie 2 Vertical 50 mL Tube Holder | Scientific Industries | SI-V506 |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- ASTM International. ASTM Standard E2562, 2017, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International. , (2017).
- Azeredo, J., et al. Critical review on biofilm methods. Critical Reviews In Microbiology. 43 (3), 313-351 (2017).
- Gomes, I. B., et al. Standardized reactors for the study of medical biofilms: a review of the principles and latest modifications. Critical Reviews in Biotechnology. 38 (5), 657-670 (2018).
- Goeres, D. M., et al., Simoes, M., et al. Design and fabrication of biofilm reactors. Recent Trends in Biofilm Sciences and Technology. , 71-88 (2020).
- Goeres, D. M., et al. A method for growing a biofilm under low shear at the air-liquid interface using the drip flow biofilm reactor. Nature Protocols. 4 (5), 783-788 (2009).
- ASTM International. ASTM Standard E2871, Standard Test Method for Determining Disinfectant Efficacy Against Biofilm Grown in the CDC Biofilm Reactor Using the Single Tube Method. ASTM International. , (2019).
- Goeres, D. M., et al. Validation of a Biofilm Efficacy Test: The Single Tube Method. Journal of Microbiological Methods. , (2019).
- The development and validation of a standard in vitro method to evaluate the efficacy of surface modified urinary catheters. Theses and Dissertations at Montana State University Available from: https://scholarworks.montana.edu/xmlui/handle/1/15149 (2019)
- Hamilton, M. A., Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M. Checking the Validity of the harvesting and Disaggregating Steps in Laboratory Tests of Surface Disinfectants. Journal of AOAC International. 92 (6), 1755-1762 (2009).
- Conlon, B. P., Rowe, S. E., Lewis, K., Donelli, G. Persister Cells in Biofilm Associated Infections. Biofilm-based Healthcare-associated Infections. , (2015).
- ASTM International. ASTM Standard E2647, Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown Using Drip Flow Biofilm Reactor with Low Shear and Continuous Flow. ASTM International. , (2020).
- Rosenberg, M., Azevedo, N., Ivask, A. Propidium iodide staining underestimates viability of adherent bacterial cells. Scientific Reports. , (2019).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Manuira-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. , (2015).
- Kobayashi, N., Bauer, T. W., Tuohy, M. J., Fujishiro, T., Procop, G. W. Brief Ultrasonication Improves Detection of Biofilm-formative Bacteria Around a Metal Implant. Clinical Orthopaedics and Related Research. 457, 210-213 (2007).
- Lourenco, A., et al. Minimum information about a biofilm experiment (MIABiE), standards for reporting experiments and data on sessile microbial communities living at interfaces. Pathogens and Disease. , 1-7 (2014).
- Nascentes, C. C., Korn, M., Sousa, C. S., Arruda, M. A. Z. Use of Ultrasonic Baths for Analytical Applications: A New Approach for Optimisation Conditions. Journal of Brazilian Chemical Society. 12 (1), 57-63 (2001).
- Elma GmbH & Co. KG TI-H Ultrasonic Cleaning Units: Operating Instructions. Elma GmbH & Co. , (2009).
- Stamper, D. M., Holm, E. R., Brizzolara, R. A. Exposure times and energy densities for ultrasonic disinfection of Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus avium and sewage. Journal of Environmental Engineering and Science. 7 (2), 139-146 (2008).
- Suslick, K. S. Sonochemistry. Science. 247 (4949), (1990).
