פרוסות ריאות חתוכות מדויקות ככלי יעיל למבנה כלי הריאות Ex vivo ולמחקרי התכווצות
Summary
מוצג כאן פרוטוקול לשימור התכווצות כלי הדם של רקמת הריאה המורינית PCLS, וכתוצאה מכך תמונה תלת ממדית מתוחכמת של כלי הדם הריאתי ודרכי הנשימה, אשר ניתן לשמר עד 10 ימים כי הוא רגיש הליכים רבים.
Abstract
ההדמיה של רקמת ריאה מורינית מספקת מידע מבני ותאי בעל ערך לגבי דרכי הנשימה הבסיסיות ו vasculature. עם זאת, שימור כלי הריאות המייצגים באמת תנאים פיזיולוגיים עדיין מציב אתגרים. בנוסף, התצורה העדינה של ריאות מורינה גורמת לאתגרים טכניים בהכנת דגימות לתמונות באיכות גבוהה המשמרות הן את הרכב התאים והן את הארכיטקטורה. באופן דומה, בדיקות התכווצות הסלולר יכולות להתבצע כדי לחקור את הפוטנציאל של תאים להגיב vasoconstrictors במבחנה, אבל בדיקות אלה אינם לשחזר את הסביבה המורכבת של הריאה שלם. בניגוד לבעיות טכניות אלה, ניתן ליישם את שיטת פרוסת הריאה המדויקת (PCLS) כחלופה יעילה להדמיית רקמת ריאה בשלושה ממדים ללא הטיה אזורית ולשמש מודל קבלנות פונדקאית חיה עד 10 ימים. רקמות מוכנות באמצעות PCLS יש מבנה משומר אוריינטציה מרחבית, מה שהופך אותו אידיאלי ללמוד תהליכי מחלה ex vivo. המיקום של תאים אנדוגניים המסומנים ב- PCLS שנקטפו ממודל מורינה של כתב tdTomato שניתן לתמצית יכול להיות חזותי בהצלחה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. לאחר חשיפה vasoconstrictors, PCLS מדגים את השימור של התכווצות כלי הדם ואת מבנה הריאות, אשר ניתן ללכוד על ידי מודול לשגות זמן. בשילוב עם ההליכים האחרים, כגון כתם מערבי וניתוח RNA, PCLS יכול לתרום להבנה מקיפה של מפלי איתות העומדים בבסיס מגוון רחב של הפרעות ולהוביל להבנה טובה יותר של הפתופיזיולוגיה במחלות כלי דם ריאתיים.
Introduction
ההתקדמות בהכנת והדמיה של רקמת ריאה המשמרת רכיבים תאיים מבלי להקריב מבנה אנטומי מספקת הבנה מפורטת של מחלות ריאות. היכולת לזהות חלבונים, RNA ותרכובות ביולוגיות אחרות תוך שמירה על מבנה פיזיולוגי מציעה מידע חיוני על הסידור המרחבי של תאים שיכולים להרחיב את ההבנה של הפתופיזיולוגיה במחלות ריאות רבות. תמונות מפורטות אלה יכולות להוביל להבנה טובה יותר של מחלות כלי דם ריאתיים, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, כאשר הם מוחלים על מודלים של בעלי חיים, מה שעלול להוביל לאסטרטגיות טיפוליות משופרות.
למרות ההתקדמות הטכנולוגית, השגת תמונות באיכות גבוהה של רקמת ריאה מורינה נותרה אתגר. מחזור הנשימה מונע על ידי לחץ תוך-אתורי שלילי שנוצר במהלך שאיפה1. כאשר באופן מסורתי להשיג ביופסיות והכנת דגימות ריאות להדמיה, שיפוע הלחץ השלילי הולך לאיבוד וכתוצאה מכך קריסת דרכי הנשימה vasculature, אשר כבר לא מייצג את עצמו במצב הנוכחי שלה. כדי להשיג תמונות מציאותיות המשקפות את התנאים הנוכחיים, יש לנפח מחדש את דרכי הנשימה הריאתיות, ואת כלי השיט, שינוי הריאה הדינמית לתוך מתקן סטטי. היישום של טכניקות ייחודיות אלה מאפשר שימור של שלמות מבנית, כלי דם ריאתי, ורכיבים תאיים, כולל תאים חיסוניים כגון מקרופאגים, המאפשר רקמת ריאה להיות גלוי קרוב ככל האפשר למצבה הפיזיולוגי.
חיתוך ריאות מדויק (PCLS) הוא כלי אידיאלי לחקר האנטומיה והפיזיולוגיה של כלי הריאות2. PCLS מספק הדמיה מפורטת של רקמת הריאה בשלושה ממדים תוך שמירה על רכיבים מבניים ותאיים. PCLS שימש במודלים של בעלי חיים ובני אדם כדי לאפשר תמונות חיות ברזולוציה גבוהה של תפקודים תאיים בשלושה ממדים, מה שהופך אותו לכלי אידיאלי לחקר מטרות טיפוליות פוטנציאליות, למדוד התכווצות דרכי הנשימה הקטנות וללמוד את הפתופיזיקה של מחלות ריאות כרוניות כגון COPD, ILD וסרטןריאות 3. באמצעות טכניקות דומות, החשיפה של דגימות PCLS vasoconstrictors יכול לשמר את מבנה הריאות ואת התכווצות כלי הדם, שכפול בתנאי הפריה. יחד עם שמירה על התכווצות, דגימות מוכנות יכולות לעבור ניתוח נוסף כגון רצף RNA, כתם מערבי, וציטומטריית זרימה כאשר הם מוכנים כראוי. לבסוף, כתב צבע מסומן עם פלואורסצנטיות tdTomato לאחר קציר ריאות יכול לשמר תיוג לאחר הכנת microslices, מה שהופך אותו אידיאלי עבור מחקרי מעקב אחר תאים. השילוב של טכניקות אלה מספק מודל מתוחכם המשמר את הסידור המרחבי של תאים והתכווצות כלי שיכול להוביל להבנה מפורטת יותר של מפלי האיתות ואפשרויות טיפוליות פוטנציאליות במחלת כלי הדם הריאתי.
בכתב יד זה, רקמת הריאה המורינה של PCLS נחשפת ל vasoconstrictors, המדגימה שלמות מבנית שמורה והתכווצות כלי. המחקר מדגים כי הרקמה מוכנה ומטופלת כראוי יכול להישאר קיימא במשך 10 ימים. המחקר מדגים גם את שימור התאים עם פלואורסצנטיות אנדוגני (tdTomato), ומאפשר דגימות לספק תמונות ברזולוציה גבוהה של vasculature ריאתי וארכיטקטורה. לבסוף, תוארו דרכים לטפל ולהכין פרוסות רקמות למדידת RNA וכתם מערבי כדי לחקור מנגנונים הבסיסיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
בכתב יד זה, שיטה משופרת לייצר תמונות ברזולוציה גבוהה של רקמת ריאה מורינה המשמרת את מבנה כלי הדם ומייעלת את הגמישות הניסיונית מתוארת, במיוחד באמצעות היישום של PCLS כדי להשיג microslices של רקמת ריאה שניתן לראות בשלושה ממדים עם התכווצות השתמרה של כלי הדם. באמצעות ריאגנט הכדאיות, הפרוטוקול מדגים כי ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לד”ר יואן האו וקייפנג ליו על התמיכה הטכנית שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH 1R01 HL150106-01A1, מלגת פארקר ב פרנסיס, ואת פרס מחקר אלדריגטי האגודה ליתר לחץ דם ריאתי לד”ר Ke יואן.
Materials
| 0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
| 1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
| 20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
| 30cc syringe | BD | 309650 | |
| Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
| Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
| Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
| Confocal | Zeiss | 880 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
| Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
| KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
| Mortar and Pestle | Amazon | ||
| RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
| Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
| UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
| Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
| Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |
References
- Sparrow, D., Weiss, S. T. Respiratory physiology. Annual Review of Gerontology & Geriatrics. 6, 197-214 (1986).
- Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (144), e58437 (2019).
- Li, G., et al. Preserving airway smooth muscle contraction in precision-cut lung slices. Scientific Reports. 10 (1), 6480 (2020).
- Rosales Gerpe, M. C., et al. Use of precision-cut lung slices as an ex vivo tool for evaluating viruses and viral vectors for gene and oncolytic therapy. Molecular Therapy: Methods & Clinical Development. 10, 245-256 (2018).
- Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
- Liu, R., et al. Mouse lung slices: An ex vivo model for the evaluation of antiviral and anti-inflammatory agents against influenza viruses. Antiviral Research. 120, 101-111 (2015).
- de Graaf, I. A., et al. Preparation and incubation of precision-cut liver and intestinal slices for application in drug metabolism and toxicity studies. Nature Protocols. 5 (9), 1540-1551 (2010).
- Alsafadi, H. N., et al. Applications and approaches for three-dimensional precision-cut lung slices. Disease modeling and drug discovery. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 62 (6), 681-691 (2020).
- Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
- Springer, J., Fischer, A. Substance P-induced pulmonary vascular remodelling in precision cut lung slices. The European Respiratory Journal. 22 (4), 596-601 (2003).
- Suleiman, S., et al. Argon reduces the pulmonary vascular tone in rats and humans by GABA-receptor activation. Scientific Reports. 9 (1), 1902 (2019).
- Rieg, A. D., et al. Cardiovascular agents affect the tone of pulmonary arteries and veins in precision-cut lung slices. PLoS One. 6 (12), 29698 (2011).
- Perez, J. F., Sanderson, M. J. The frequency of calcium oscillations induced by 5-HT, ACH, and KCl determine the contraction of smooth muscle cells of intrapulmonary bronchioles. The Journal of General Physiology. 125 (6), 535-553 (2005).
- Deng, C. Y., et al. Upregulation of 5-hydroxytryptamine receptor signaling in coronary arteries after organ culture. PLoS One. 9 (9), 107128 (2014).
- Sandker, S. C., et al. Adventitial dissection: A simple and effective way to reduce radial artery spasm in coronary bypass surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 17 (5), 784-789 (2013).
- Naik, J. S., et al. Pressure-induced smooth muscle cell depolarization in pulmonary arteries from control and chronically hypoxic rats does not cause myogenic vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 98 (3), 1119-1124 (2005).
- Lopez-Lopez, J. G., et al. Diabetes induces pulmonary artery endothelial dysfunction by NADPH oxidase induction. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (5), 727-732 (2008).
- Gonzalez-Tajuelo, R., et al. Spontaneous pulmonary hypertension associated with systemic sclerosis in P-selectin glycoprotein Ligand 1-deficient mice. Arthritis & Rheumatology. 72 (3), 477-487 (2020).
- Bai, Y., Sanderson, M. J. Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).
- Nishiyama, S. K., et al. Vascular function and endothelin-1: tipping the balance between vasodilation and vasoconstriction. Journal of Applied Physiology. 122 (2), 354-360 (2017).
- Schneider, M. P., Inscho, E. W., Pollock, D. M. Attenuated vasoconstrictor responses to endothelin in afferent arterioles during a high-salt diet. American Journal of Physiology. Renal Physiology. 292 (4), 1208-1214 (2007).
- Inscho, E. W., Imig, J. D., Cook, A. K. Afferent and efferent arteriolar vasoconstriction to angiotensin II and norepinephrine involves release of Ca2+ from intracellular stores. Hypertension. 29, 222-227 (1997).
- Vecchione, C., et al. Protection from angiotensin II-mediated vasculotoxic and hypertensive response in mice lacking PI3Kgamma. The Journal of Experimental Medicine. 201 (8), 1217-1228 (2005).
