Les tranches pulmonaires coupées avec précision comme outil efficace pour les études ex vivo sur la structure et la contractilité des vaisseaux pulmonaires

Summary

Présenté ici est un protocole pour préserver la contractilité vasculaire du tissu pulmonaire murin PCLS, résultant en une image tridimensionnelle sophistiquée du système vasculaire pulmonaire et des voies respiratoires, qui peut être préservée jusqu’à 10 jours et qui est sensible à de nombreuses procédures.

Abstract

La visualisation du tissu pulmonaire murin fournit des informations structurelles et cellulaires précieuses concernant les voies respiratoires et le système vasculaire sous-jacent. Cependant, la préservation des vaisseaux pulmonaires qui représente vraiment des conditions physiologiques présente encore des défis. De plus, la configuration délicate des poumons murins entraîne des défis techniques dans la préparation d’échantillons pour des images de haute qualité qui préservent à la fois la composition cellulaire et l’architecture. De même, des tests de contractilité cellulaire peuvent être effectués pour étudier le potentiel des cellules à répondre aux vasoconstricteurs in vitro,mais ces tests ne reproduisent pas l’environnement complexe du poumon intact. Contrairement à ces problèmes techniques, la méthode de la tranche pulmonaire coupée avec précision (PCLS) peut être appliquée comme une alternative efficace pour visualiser le tissu pulmonaire en trois dimensions sans biais régional et servir de modèle de contractilité de substitution vivant jusqu’à 10 jours. Les tissus préparés à l’aide de PCLS ont conservé la structure et l’orientation spatiale, ce qui les rend idéaux pour étudier les processus pathologiques ex vivo. L’emplacement des cellules endogènes tdTomato-marqué dans le PCLS récoltées à partir d’un modèle murin tdTomato reporter inductible peut être visualisé avec succès par microscopie confocale. Après exposition à des vasoconstricteurs, le PCLS démontre la préservation de la contractilité des vaisseaux et de la structure pulmonaire, qui peuvent être capturées par un module time-lapse. En combinaison avec les autres procédures, telles que le transfert de Western et l’analyse de l’ARN, le PCLS peut contribuer à la compréhension globale des cascades de signalisation qui sous-tendent une grande variété de troubles et conduire à une meilleure compréhension de la physiopathologie dans les maladies vasculaires pulmonaires.

Introduction

Les progrès dans la préparation et l’imagerie du tissu pulmonaire qui préserve les composants cellulaires sans sacrifier la structure anatomique fournissent une compréhension détaillée des maladies pulmonaires. La capacité d’identifier les protéines, l’ARN et d’autres composés biologiques tout en maintenant la structure physiologique offre des informations vitales sur l’arrangement spatial des cellules qui peuvent élargir la compréhension de la physiopathologie dans de nombreuses maladies pulmonaires. Ces images détaillées peuvent conduire à une meilleure compréhension des maladies vasculaires pulmonaires, telles que l’hypertension artérielle pulmonaire, lorsqu’elles ....

Protocol

Tous les soins aux animaux ont été conformes aux lignes directrices du Boston Children’s Hospital et les protocoles approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Les souris utilisées dans cette étude sont des souris sauvages de type C57/B6 et des souris croisées Cdh5-CreERT2 x Ai14 tdTomato.

1. Préparation des solutions

1. Préparer à l’avance une solution tampon de phosphate (1x PBS) et une solution d’agarose à 2% requise pendant l’expérience.
   1. Mélanger 2 g de poudre d’agarose dans 100 mL d’eau autoclavée. Chauffez-le au micro-ondes quelques secondes à la fois jusqu’à ce que la solution soit cla....

Results

Lorsqu’il est ajouté aux cellules ou aux tissus, le réactif de viabilité est modifié par l’environnement réducteur des tissus viables et devient rose / rouge, devenant très fluorescent. Les changements de couleur représentatifs détectés du jour 0-1 et du jour 9-10 sont illustrés à la figure 3. Comme indiqué, la solution a commencé en bleu et est devenue rose du jour au lendemain, démontrant ainsi sa viabilité. Le changement de couleur se produit généralement dans les 1-4 h; cependant, un dél.......

Discussion

Dans ce manuscrit, une méthode améliorée pour produire des images à haute résolution du tissu pulmonaire murin qui préserve la structure vasculaire et optimise la flexibilité expérimentale est décrite, en utilisant spécifiquement l’application de PCLS pour obtenir des microslices de tissu pulmonaire qui peuvent être visualisés en trois dimensions avec une contractilité préservée du système vasculaire. En utilisant le réactif de viabilité, le protocole démontre que des tranches soigneusement préparées et conservées peuven.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 cc d’héparine fractionnée dans la seringue	BD	100 unités USP par mL
1X PBS	Corning	; 21-040-CM
Aiguille à extrémité émoussée de calibre 20 1/2 pouce pour canulation de la trachée	Cml Supply	90120050D
Seringue 30cc	BD	309650
Anti Anti solution	Gibco	15240096
Microtome à lame vibrante automatisée	Leica	VT1200S
Cell Viability Reagent (alamarBlue)	Thermofisher	DAL1025
Confocéphale	Zeiss	880
Dulbecco' s Eagle Medium modifié et GLutaMAX, complété par 10 % de FBS, 1 % Pen/Strep	Gibco	10569-010
Endothelin-1	Sigma	E7764
KCl	Sigma	7447-40-7
Mortier et pilon	Amazon
RIPA Tampon de lyse et d’extraction	Thermoscientific	89900
Suture chirurgicale 6/0	FST	18020-60
TRIzol Réactif	Invitrogen, Thermofisher	15596026
UltraPure Agarose à bas point de fusion	Invitrogen	16520050
Vibratome	Leica Biosystems	VT1200 S
Kit de prélèvement sanguin ailé (aiguille papillon) 25-30G	BD	25-30G