Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het behoud van de vasculaire contractiliteit van PCLS-muizenlongweefsel, wat resulteert in een geavanceerd driedimensionaal beeld van de pulmonale vasculatuur en de luchtwegen, die tot 10 dagen kunnen worden bewaard en die vatbaar zijn voor tal van procedures.
De visualisatie van murine longweefsel biedt waardevolle structurele en cellulaire informatie over de onderliggende luchtweg en vasculatuur. Het behoud van longvaten dat echt fysiologische omstandigheden vertegenwoordigt, brengt echter nog steeds uitdagingen met zich mee. Bovendien resulteert de delicate configuratie van muizenlongen in technische uitdagingen bij het voorbereiden van monsters voor beelden van hoge kwaliteit die zowel de cellulaire samenstelling als de architectuur behouden. Evenzo kunnen cellulaire contractiliteitstests worden uitgevoerd om het potentieel van cellen te bestuderen om in vitroop vasoconstrictoren te reageren , maar deze testen reproduceren niet de complexe omgeving van de intacte long. In tegenstelling tot deze technische problemen, kan de precisie-cut lung slice (PCLS) -methode worden toegepast als een efficiënt alternatief om longweefsel in drie dimensies te visualiseren zonder regionale vertekening en dienen als een live surrogaatcontractiliteitsmodel voor maximaal 10 dagen. Weefsel bereid met behulp van PCLS heeft een behouden structuur en ruimtelijke oriëntatie, waardoor het ideaal is om ziekteprocessen ex vivo te bestuderen. De locatie van endogene tdTomato-gelabelde cellen in PCLS geoogst uit een induceerbare tdTomato reporter murine model kan met succes worden gevisualiseerd door confocale microscopie. Na blootstelling aan vasoconstrictoren demonstreert PCLS het behoud van zowel vessel contractiliteit als longstructuur, die kan worden vastgelegd door een time-lapse module. In combinatie met de andere procedures, zoals western blot- en RNA-analyse, kan PCLS bijdragen aan het uitgebreide begrip van signaalcascades die ten grondslag liggen aan een breed scala aan aandoeningen en leiden tot een beter begrip van de pathofysiologie bij longvasculaire aandoeningen.
Vooruitgang in de voorbereiding en beeldvorming van longweefsel dat cellulaire componenten behoudt zonder de anatomische structuur op te offeren, biedt een gedetailleerd inzicht in longziekten. Het vermogen om eiwitten, RNA en andere biologische verbindingen te identificeren met behoud van fysiologische structuur biedt essentiële informatie over de ruimtelijke ordening van cellen die het begrip van de pathofysiologie bij tal van longziekten kan verbreden. Deze gedetailleerde beelden kunnen leiden tot een beter begrip van pulmonale vaatziekten, zoals pulmonale arterie hypertensie, wanneer toegepast op diermodellen, wat mogelijk kan leiden tot verbeterde therapeutische strategieën.
Ondanks de technologische vooruitgang blijft het verkrijgen van hoogwaardige beelden van muizenlongweefsel een uitdaging. De ademhalingscyclus wordt aangedreven door een negatieve intrathoracale druk die wordt gegenereerd tijdens inademing1. Bij het traditioneel verkrijgen van biopsieën en het voorbereiden van longmonsters voor beeldvorming, gaat de negatieve drukgradiënt verloren, wat resulteert in de ineenstorting van de luchtweg en vasculatuur, die zichzelf niet langer in zijn huidige staat vertegenwoordigt. Om realistische beelden te krijgen die de huidige omstandigheden weerspiegelen, moeten de pulmonale luchtwegen opnieuw worden opgeblazen en de vasculatuur worden doordrenkt, waardoor de dynamische long in een statisch armatuur verandert. De toepassing van deze verschillende technieken maakt het behoud van structurele integriteit, pulmonale vasculatuur en cellulaire componenten mogelijk, inclusief immuuncellen zoals macrofagen, waardoor longweefsel zo dicht mogelijk bij zijn fysiologische toestand kan worden bekeken.
Precision cut lung slicing (PCLS) is een ideaal hulpmiddel voor het bestuderen van de anatomie en fysiologie van pulmonale vasculatuur2. PCLS biedt gedetailleerde beeldvorming van het longweefsel in drie dimensies met behoud van structurele en cellulaire componenten. PCLS is gebruikt in dier- en menselijke modellen om levende beelden met hoge resolutie van cellulaire functies in drie dimensies mogelijk te maken, waardoor het een ideaal hulpmiddel is om potentiële therapeutische doelen te bestuderen, kleine luchtwegcontractie te meten en de pathofysiologie van chronische longziekten zoals COPD, ILD en longkanker te bestuderen3. Met behulp van vergelijkbare technieken kan de blootstelling van PCLS-monsters aan vasoconstrictoren de longstructuur en vatcontractiliteit behouden, waardoor in vitro omstandigheden worden gerepliceert. Naast het behoud van contractiliteit, kunnen voorbereide monsters aanvullende analyses ondergaan, zoals RNA-sequencing, Western blot en flowcytometrie wanneer ze correct worden bereid. Ten slotte kunnen reporter kleur gelabelde cellen gemarkeerd met tdTomato-fluorescentie na longoogst de etikettering behouden na het bereiden van microslices, waardoor het ideaal is voor celvolgstudies. De integratie van deze technieken biedt een geavanceerd model met behoud van de ruimtelijke ordening van cellen en vatcontractiliteit die kan leiden tot een meer gedetailleerd begrip van de signaalcascades en potentiële therapeutische opties bij pulmonale vasculatuurziekte.
In dit manuscript wordt PCLS-muizenlongweefsel blootgesteld aan vasoconstrictoren, wat een behouden structurele integriteit en vatcontractiliteit aantoont. De studie toont aan dat het weefsel dat op de juiste manier is voorbereid en behandeld, 10 dagen levensvatbaar kan blijven. De studie toont ook het behoud van cellen met endogene fluorescentie (tdTomato), waardoor monsters beelden met hoge resolutie van de pulmonale vasculatuur en architectuur kunnen leveren. Ten slotte zijn manieren beschreven om weefselplakken te hanteren en voor te bereiden voor RNA-meting en Western blot om onderliggende mechanismen te onderzoeken.
In dit manuscript wordt een verbeterde methode beschreven om hoge resolutie beelden van murien longweefsel te produceren die de vasculaire structuur behoudt en experimentele flexibiliteit optimaliseert, met name met behulp van de toepassing van PCLS om microslices van longweefsel te verkrijgen die in drie dimensies kunnen worden bekeken met behoud van contractiliteit van de vasculatuur. Met behulp van het levensvatbaarheidsreagens toont het protocol aan dat zorgvuldig bereide en bewaarde plakjes de levensvatbaarheid lang…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen Drs. Yuan Hao en Kaifeng Liu bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door een NIH 1R01 HL150106-01A1, de Parker B. Francis Fellowship en de Pulmonary Hypertension Association Aldrighetti Research Award aan Dr. Ke Yuan.
0.5cc of fractionated heparin in syringe | BD | 100 USP units per mL | |
1X PBS | Corning | 21-040-CM | |
20 1/2 inch gauge blunt end needle for trachea cannulation | Cml Supply | 90120050D | |
30cc syringe | BD | 309650 | |
Anti Anti solution | Gibco | 15240096 | |
Automated vibrating blade microtome | Leica | VT1200S | |
Cell Viability Reagent (alamarBlue) | Thermofisher | DAL1025 | |
Confocal | Zeiss | 880 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium and GLutaMAX, supplemented with 10% FBS, 1% Pen/Strep | Gibco | 10569-010 | |
Endothelin-1 | Sigma | E7764 | |
KCl | Sigma | 7447-40-7 | |
Mortar and Pestle | Amazon | ||
RIPA lysis and extraction buffer | Thermoscientific | 89900 | |
Surgical suture 6/0 | FST | 18020-60 | |
TRIzol Reagent | Invitrogen, Thermofisher | 15596026 | |
UltraPure Low Melting Point Agarose | Invitrogen | 16520050 | |
Vibratome | Leica Biosystems | VT1200 S | |
Winged blood collection set (Butterfly needle) 25-30G | BD | 25-30G |