イン・ヴィトロ E3ユビキチンリガーゼ関数の解析
Summary
本研究は、E3ユビキチンリガーゼ触媒活性の分析のための詳細な インビトロ ユビキトリメンテーションアッセイプロトコルを提供する。組換えタンパク質は 、大腸菌 培養などの原核生物系を用いて発現した。
Abstract
ユビキチン(Ub)の共有結合は、基質タンパク質の内部リジン残基(複数可)に、ユビキテリメンテーションと呼ばく、真核生物における翻訳後の最も重要な修飾の1つを表す。ユビキチン活性化酵素(E1酵素)、ユビキチン結合酵素(E2酵素)、ユビキチンリガス(E3酵素)、時にはユビキチン鎖伸長因子(E4酵素)を含む3つの酵素クラスの順次カスケードによって媒介される。ここでは、ユビキチンリガーゼ活性の評価、E2-E3対の連携、および基板選択を可能にする、ユビキタス化アッセイのための インビトロ プロトコルが提供される。協力E2-E3ペアは、E3リガーゼのフリーポリユビキチン鎖および/または自動ユビキトリメンテーションの生成を監視することによってスクリーニングすることができます。基質のユビキタス化は、E3リガーゼの選択的結合によって定義され、 インビトロ 反応のウェスタンブロッティングによって検出することができる。さらに、E2〜Ub排出アッセイが記載されており、機能性E2-E3連携の直接評価に有用なツールである。ここで、ユビキチンのE3依存性転写は、対応するE2酵素からフリーリジンアミノ酸(模倣基質のユビキタス化)またはE3リガーゼ自体の内部リジン(自動ユビキトリメンテーション)に続く。結論として、E3リガーゼ触媒機能に対処するために高速かつ簡単に実行できる3つの異なる in vitro プロトコルが提供されています。
Introduction
Ubiquitylationは、Ubが基質タンパク質1に共有結合するプロセスです。Ub修飾は、3つの異なる酵素クラス、すなわちUb活性化酵素(E1s)、Ub共役酵素(E2s)、Ubリガシュ(E3s)、およびおそらくUb鎖伸長因子(E4s)2、3、4、5の作用を伴う連続した酵素反応によって触媒される。アデノシン三リン酸(ATP)−マグネシウム(Mg2+)依存性E1によるUbの活性化後、E1の活性部位システインはUbのC末端グリシンを攻撃し、チオエステル複合体(Ub〜E1)を形成する。ATP加水分解から引き出されたエネルギーは、Ubが高エネルギー過渡状態を達成し、次の酵素カスケード全体にわたって維持される。次に、E2酵素は活性化されたUbをその内部触媒システインに転移させ、それによって一過性のUb〜E2チオエステル結合を形成する。続いて、Ubは基質タンパク質に移される。
これは 2 つの方法で実行できます。E3リガーゼは、最初にE2に結合するか、またはE3リガーゼが直接Ubを結合することができる。後者の方法は、E3〜Ub中間体の形成をもたらす。いずれの場合も、Ubは、UbのC末端カルボキシル基と基質のリジンƐ-アミノ基の間にイソペプチド結合を形成することにより基質タンパク質に連結される。ヒトゲノムは、2つのE1、約40 E2、および600以上の推定ユビキチンリガーゼ7をコードする。E3のUb転送機構に基づいて、Ubリガーゼは相同からE6APC末語(HECT)型、本当に興味深い新遺伝子(RING)/Uボックス型、およびリング間のリング(RBR)型リガス8を含む3つのカテゴリに分かれています。本研究では、HSC70相互作用タンパク質のリガーゼ、カルボキシル末テルミナス(CHIP)を含むUボックスを、代表的なE3酵素として用いる。UB〜E3チオエステルを形成するHECT型E3型酵素とは対照的に、CHIPのUボックスドメインはE2〜Ubに結合し、E2酵素8,9から直接Ub/基質転移を促進する。酵素機能のUボックスの重要性に基づいて、非アクティブなCHIP Uボックス変異体CHIP(H260Q)をコントロールとして利用します。CHIP(H260Q) は、その同質E2sに結合できないため、E3リガーゼ活動10を失う。
タンパク質のユビキタス化は、真核細胞の細胞イベントの多数を調節する上で重要な役割を果たしています。Ub分子の基質タンパク質への可逆的な結合によって促進される細胞の結果の多様性は、Ubの分子特性に起因する可能性がある。Ub自体は、さらにユビキタス化のための7つのリジン(K)残基を含むので、異なるサイズおよび/またはトポロジー11を有するUbチェーンタイプの豊富な多様性がある。例えば、基質は、1つのUb分子(モノユビキタンション)または複数のリジン(マルチモノユビキタン化)、さらにはUb鎖(ポリユビキティメンテーション)11で修飾することができる。Ub鎖は、Ubの同じまたは異なるリジン残基を介してホモまたはヘテロタイプのいずれかであり、分岐されたUb鎖9を生じる可能性さえある。したがって、タンパク質のユビキタス化は、特定の情報を提供するUb分子の多様な配置、例えば、共役タンパク質12、13の分解、活性化、または局在化に対して導く。これらの異なるUb信号は、変化する環境ニーズに対応する細胞の能力のための重要な要件である細胞シグナル伝達経路の迅速な再プログラミングを可能にします。
ユビキタス化の中心的な側面は、タンパク質の品質管理に関連しています。誤って折り畳まれたか、または不可逆的に損傷を受けたタンパク質は、タンパク質ホメオスタシスまたはプロテオスタシス14を維持するために、新たに合成されたタンパク質に分解して置き換える必要があります。品質管理E3リガーゼ、CHIPは、損傷したタンパク質9、15、16、17のUb依存分解における分子シャペロンと協力する。それとは別に、CHIPは、筋肉機能と最適レベルからの逸脱がヒトミオパシー18、19、20、21につながるミオシン指向シャペロン、UNC-45B(Unc-45ホモログB)の安定性を調節する。26SプロテアソームによるUNC-45Bの分解は、K48結合ポリユーバ鎖9の付着によって媒介される。基質タンパク質の存在しない場合、CHIPは、リング/UボックスE3ユビキチンリガス24、25の特徴であるオートユビキトリエーション10、22、23を行い、リガーゼ活性26を調節すると考えられる。本論文に記載されたインビトロのユビキタス化アッセイ法の適用は、CHIPと提携するE2酵素を体系的に同定し、CHIPの自由なポリユーブ鎖および/またはオートユビキトリスの形成を促進するのに役立った(プロトコルセクション2)。さらに、チップ依存性UNC-45Bのユビキタス化が認められ、これはE3リガーゼ18、19(プロトコルセクション3)の既知の基質である。最終的に、Ub〜E2チオスターからの活性化されたUbのCHIP依存的な転送を監視した(プロトコルセクション4)。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文では、E3リガーゼ機能の解析に関するイン ビトロ のユビキタス化法の基礎について述べている。 インビトロ のユビキタス化アッセイを行う場合、一部のE2酵素は、活性部位30に近接して位置する自身のリジン残基に対する活性システインの攻撃に起因して、自己ユビキタス化を行うことができるものもあると考えるべきである。この問題を回避するため…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、重要な議論と原稿に関する有益なアドバイスのために私たちの研究室のメンバーに感謝します。サイズ制限により貴重な貢献を挙げたもので、お詫び申し上げます。この作品は、ドイツ・フォルシュングスゲマイインシャフト(DFG、ドイツ研究財団)-SFB 1218 – プロジェクトン番号269925409とクラスター・オブ・エクセレンスEXC 229/ CECADからTHに支援されています。この作品は、ドイツの卓越性戦略の下でドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)によって資金提供されました – EXC 2030 – 390661388と – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 T.H. ディース・アルベート・ヴルデ・フォン・デア・ドイセン・フォルシュンスゲマイインシャフト (DFG) イム・ラーメン・デア・ドイメン・エキゼレンツラティー – EXC 2030 – 390661388ウント – SFB 1218 – プロジェクトヌマー: 269925409 T.H.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
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