Summary
O presente estudo fornece protocolos de ensaio de on-lona in vitro detalhados para a análise da atividade catalítica da ubiquitina E3. Proteínas recombinantes foram expressas usando sistemas procarióticos como a cultura Escherichia coli.
Abstract
A ligação covalente da ubiquitina (Ub) com resíduos de lisemina interna de uma proteína substrato, um processo denominado ubiquidade, representa uma das modificações pós-translacionais mais importantes em organismos eucarióticos. A ubiquização é mediada por uma cascata sequencial de três classes enzimes, incluindo enzimas ativadoras de ubiquitina (enzimas E1), enzimas conjugadoras de ubiquitina (enzimas E2) e ligaduras de ubiquitina (enzimas E3), e às vezes, fatores de alongamento da cadeia de ubiquitina (enzimas E4). Aqui, são fornecidos protocolos in vitro para ensaios de ubiquização, que permitem a avaliação da atividade ligase de ubiquitina E3, a cooperação entre pares E2-E3 e seleção de substratos. Os pares E2-E3 cooperantes podem ser rastreados monitorando a geração de cadeias gratuitas de poli-ubiquínea e/ou auto-ubiquização da ligase E3. A ubiquização do substrato é definida por ligação seletiva da liga ligase E3 e pode ser detectada por manchas ocidentais da reação in vitro. Além disso, é descrito um ensaio de descarga E2~Ub, que é uma ferramenta útil para a avaliação direta da cooperação funcional do E2-E3. Aqui, a transferência de ubiqutina dependente do E3 é seguida da enzima E2 correspondente para aminoácidos de lisina livre (imitando ubiquidades substratos) ou lisinas internas da própria Ligase E3 (auto-ubiquização). Em conclusão, são fornecidos três protocolos in vitro diferentes que são rápidos e fáceis de executar para abordar a funcionalidade catalítica do E3 ligase.
Introduction
A ubiquização é o processo pelo qual a Ub está covalentemente ligada a uma proteína substrato1. A modificação da Ub é catalisada por sucessivas reações enzimáticas envolvendo a ação de três classes enzimáticas diferentes, ou seja,e ., enzimas ativantes de Ub (E1s), enzimas ub-conjugadoras (E2s), ligaduras ub (E3s) e possivelmente fatores de alongamento da cadeia Ub (E4s)2,3,4,5. Após a adenosina triphosfato (ATP)- e a ativação dependente de magnésio (Mg2+)-dependent da Ub by E1, o local ativo cisteína do E1 ataca a glicecina terminal C da Ub, formando um complexo de tioéster (Ub~E1). A energia extraída da hidrólise ATP faz com que o Ub atinja um estado de transição de alta energia, que é mantido em toda a seguinte cascata enzimávia. Em seguida, a enzima E2 transfere a Ub ativada para sua cisteína catalítica interna, formando assim um vínculo de tiaester Ub~E2 transitório. Posteriormente, Ub é transferido para a proteína do substrato.
Isso pode ser feito de duas maneiras. Ou a ligadura E3 pode primeiro ligar-se ao E2, ou a liga ligase E3 pode ligar diretamente ub. Esta última forma resulta na formação de um intermediário E3~Ub. Em ambos os casos, a Ub está ligada à proteína do substrato por formação de vínculo isopeptida entre o grupo carboxíl terminal C da Ub e o grupo lysine Ɛ-amino do substrato6. O genoma humano codifica dois E1s, aproximadamente 40 E2s, e mais de 600 ligaduras putativas de ubiquitina7. Com base no mecanismo de transferência ub do E3, as ligases Ub são divididas em três categorias envolvendo ligaduras homologous para E6AP C-Terminus (HECT)-type, Really Interesting New Gene (RING)/U-box-type, e RING entre ligases tipo RING (RBR)8. Neste estudo, a caixa U contendo ligase, Carboxyl Terminus of HSC70-interacting Protein (CHIP), é usada como enzima E3 representativa. Em contraste com as enzimas E3 do tipo HECT que formam thioesters Ub~E3, o domínio da caixa U do CHIP liga E2~Ub e promove a transferência subsequente de Ub/substrato diretamente da enzima E28,9. Com base na importância da caixa U para a função enzimática, um mutante de caixa U inativo, CHIP(H260Q), é utilizado como um controle. CHIP(H260Q) não se liga aos seus E2s cognatos, perdendo assim sua atividade de ligadura E310.
A ubiquidade proteica desempenha um papel crucial na regulação de uma infinidade de eventos celulares em células eucarióticas. A diversidade de desfechos celulares que são promovidos pelo apego reversível das moléculas ub às proteínas substratos pode ser atribuída às características moleculares da Ub. Como a própria Ub contém sete resíduos de liseina (K) para posterior ubiquização, há uma rica variedade de tipos de cadeia Ub com diferentes tamanhos e/ou topologias11. Por exemplo, substratos podem ser modificados por uma única molécula Ub em uma (mono-ubiquização) ou lises múltiplas (multi-ubiquidade), e até mesmo por cadeias ub (poli-ubiquização)11. As cadeias ub são formadas homo ou heterotipicamente através dos mesmos ou diferentes resíduos de ub, o que poderia até resultar em cadeias ub ramificadas9. Assim, a ubiquização proteica leva a diversos arranjos de moléculas ub que fornecem informações específicas, por exemplo,para degradação, ativação ou localização de proteínas conjugadas12,13. Esses diferentes sinais ub permitem a reprogramação rápida de vias de sinalização celular, o que é um requisito importante para a capacidade da célula de responder às mudanças nas necessidades ambientais.
Um aspecto central da ubiquização está relacionado ao controle da qualidade da proteína. Proteínas mal dobradas ou irreversivelmente danificadas devem ser degradadas e substituídas por proteínas recém-sintetizadas para manter a homeostase proteica ou proteostase14. O controle de qualidade E3 ligase, CHIP, colabora com acompanhantes moleculares na degradação dependente de Ub de proteínas danificadas9,15,16,17. Além disso, o CHIP regula a estabilidade do acompanhante dirigido por miosina, UNC-45B (Unc-45 Homolog B), que é fortemente coordenado com função muscular e desvios dos níveis ideais levam à miopatia humana18,19,20,21. A degradação do UNC-45B pelo proteasome 26S é mediada pelo apego de uma cadeia de9poly-Ub ligada a K48 . Na ausência de proteínas de substrato, o CHIP realiza a auto-ubiquização10,22,23, que é característica das ligaduras de ubiquitina RING/U E324,25 e considerada para regular a atividade ligadura26. A aplicação dos métodos de ensaio de onipresença in vitro descritos neste artigo ajudou a identificar sistematicamente enzimas E2 que se unem ao CHIP para promover a formação de cadeias poli-ub gratuitas e/ou auto-ubiquização do CHIP (seção de protocolo 2). Além disso, observou-se a ubiquização dependente do CHIP da UNC-45B, que é um substrato conhecido da ligadura E318,19 (seção de protocolo 3). Em última análise, a transferência dependente de CHIP de Ub ativado do tioester Ub~E2 foi monitorada (seção de protocolo 4).
Protocol
Representative Results
Discussion
Este artigo descreve métodos básicos de ubiquização in vitro para a análise da função ligase E3. Ao realizar ensaios de onipresençação in vitro, deve-se considerar que algumas enzimas E2 podem realizar auto-ubiquidade devido ao ataque de sua cisteína ativa em seus próprios resíduos de lisesina que estão localizados nas proximidades do local ativo30. Para contornar esse problema, recomenda-se o uso de um mutante E2 no qual o respectivo resíduo de lise é trocado por…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos aos membros do nosso laboratório por discussão crítica e conselhos úteis sobre o manuscrito. Pedimos desculpas por não ter citado contribuições valiosas devido à limitação de tamanho. Este trabalho é apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 e Cluster of Excellence EXC 229/ CECAD to TH. Este trabalho foi financiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) sob a Estratégia de Excelência da Alemanha – EXC 2030 – 390661388 e – SFB 1218 – Projektnumber 269925409 à T.H. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) im Rahmen der deutschen Exzellenzstrategie – EXC 2030 – 390661388 und – SFB 1218 – Projektnummer: 269925409 um T.H. gefördert.
Materials
| Amershan Protran 0.1 µm NC | GE Healthcare | 10600000 | nitrocellulose membrane |
| Anti-CHIP | Cell Signaling | 2080 | Monoclonal rabbit anti-CHIP antibody, clone C3B6 |
| Anti-MYC | Roche | OP10 | Monoclonal mouse anti-MYC antibody, clone 9E10 |
| Anti-ubiquitin | Upstate | 05-944 | Monoclonal mouse anti-Ub antibody, clone P4D1-A11 |
| Apyrase | Sigma | A6535-100UN | |
| ATP (10x) | Enzo | 12091903 | |
| BSA | Sigma | A6003-10G | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| KCl | Roth | 6781.1 | |
| K2HPO4 | Roth | P749.2 | |
| KH2PO4 | Roth | 3904.1 | |
| LDS sample buffer (4x) | novex | B0007 | |
| L-Lysine | Sigma | L5501-5G | |
| MES | Roth | 4256.4 | |
| MeOH | VWR Chemicals | 2,08,47,307 | 100% |
| Milchpulver | Roth | T145.3 | |
| NaCl | Roth | P029.3 | |
| NuPAGE Antioxidant | invitrogen | NP0005 | |
| NuPAGE Transfer buffer (20x) | novex | NP0006-1 | |
| Page ruler plus | Thermo Fisher | 26619 | Protein ladder |
| RotiBlock | Roth | A151.1 | Blocking reagent |
| SDS (20%) | Roth | 1057.1 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio Rad | 1852196 | |
| Trans-Blot Turbo | Bio Rad | 1704150EDU | Transfer system |
| Tris base | Roth | 4855.3 | |
| Tween 20 | Roth | 9127.2 | |
| UbcH Enzyme Set | BostonBiochem | K-980B | E2 enzymes |
| Ubiquitin | BostonBiochem | U-100H | |
| Ubiquitin-activating enzyme E1 | Enzo | BML-UW941U-0050 | |
| Ubiquitylation buffer (10x) | Enzo | BML-KW9885-001 | |
| Whatman blotting paper | Bio Rad | 1703969 | Extra thick filter paper |
References
- Kuhlbrodt, K., Mouysset, J., Hoppe, T. Orchestra for assembly and fate of polyubiquitin chains. Essays in Biochemistry. 41, 1-14 (2005).
- Pickart, C. M., Eddins, M. J. Ubiquitin: structures, functions, mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta. 1695 (1-3), 55-72 (2004).
- Dye, B. T., Schulman, B. A. Structural mechanisms underlying posttranslational modification by ubiquitin-like proteins. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 36, 131-150 (2007).
- Koegl, M., et al. A novel ubiquitination factor, E4, is involved in multiubiquitin chain assembly. Cell. 96 (5), 635-644 (1999).
- Hoppe, T. Multiubiquitylation by E4 enzymes: ‘one size’ doesn’t fit all. Trends in Biochemical Sciences. 30 (4), 183-187 (2005).
- Stewart, M. D., Ritterhoff, T., Klevit, R. E., Brzovic, P. S. E2 enzymes: more than just the middle men. Cell Research. 26 (4), 423-440 (2016).
- Clague, M. J., Heride, C., Urbé, S. The demographics of the ubiquitin system. Trends in Cell Biology. 25 (7), 417-426 (2015).
- Buetow, L., Huang, D. T. Structural insights into the catalysis and regulation of E3 ubiquitin ligases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (10), 626-642 (2016).
- French, M. E., Koehler, C. F., Hunter, T. Emerging functions of branched ubiquitin chains. Cell Discovery. 7, 6 (2021).
- Hatakeyama, S., Yada, M., Matsumoto, M., Ishida, N., Nakayama, K. I. U box proteins as a new family of ubiquitin-protein ligases. Journal of Biological Chemistry. 276 (35), 33111-33120 (2001).
- Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Reports. 16 (9), 1071-1083 (2015).
- Deshaies, R. J., Joazeiro, C. A. RING domain E3 ubiquitin ligases. Annual Review of Biochemistry. 78, 399-434 (2009).
- Hochstrasser, M. Lingering mysteries of ubiquitin-chain assembly. Cell. 124 (1), 27-34 (2006).
- Hoppe, T., Cohen, E. Organismal protein homeostasis mechanisms. Génétique. 215 (4), 889-901 (2020).
- Okiyoneda, T., et al. Peripheral protein quality control removes unfolded CFTR from the plasma membrane. Science. 329 (5993), 805-810 (1997).
- Tawo, R., et al. The Ubiquitin ligase CHIP integrates proteostasis and aging by regulation of insulin receptor turnover. Cell. 169 (3), 470-482 (2017).
- Albert, M. C., et al. CHIP ubiquitylates NOXA and induces its lysosomal degradation in response to DNA damage. Cell Death and Disease. 11 (9), 740 (2020).
- Hoppe, T., et al. Regulation of the myosin-directed chaperone UNC-45 by a novel E3/E4-multiubiquitylation complex in C. elegans. Cell. 118 (3), 337-349 (2004).
- Kim, J., Löwe, T., Hoppe, T. Protein quality control gets muscle into shape. Trends in Cell Biology. 18 (6), 264-272 (2008).
- Janiesch, P. C., et al. The ubiquitin-selective chaperone CDC-48/p97 links myosin assembly to human myopathy. Nature Cell Biology. 9 (4), 379-390 (2007).
- Donkervoort, S., et al. Pathogenic variants in the myosin chaperone UNC-45B cause progressive myopathy with eccentric cores. The American Journal of Human Genetics. 107 (6), 1078-1095 (2020).
- Murata, S., Minami, Y., Minami, M., Chiba, T., Tanaka, K. CHIP is a chaperone-dependent E3 ligase that ubiquitylates unfolded protein. EMBO Reports. 2 (12), 1133-1138 (2001).
- Jiang, J., et al. CHIP is a U-box-dependent E3 ubiquitin ligase: identification of Hsc70 as a target for ubiquitylation. Journal of Biological Chemistry. 276 (64), 42938-42944 (2001).
- Yang, Y., Yu, X. Regulation of apoptosis: the ubiquitous way. The FASEB Journal. 17 (8), 790-799 (2003).
- Lamothe, B., et al. TRAF6 ubiquitin ligase is essential for RANKL signaling and osteoclast differentiation. Biochemical and Biophysical Research Communication. 359 (4), 1044-1049 (2007).
- Amemiya, Y., Azmi, P., Seth, A. Autoubiquitination of BCA2 RING E3 ligase regulates its own stability and affects cell migration. Molecular Cancer Research. 6 (9), 1385 (2008).
- Brzovic, P. S., Lissounov, A., Christensen, D. E., Hoyt, D. W., Klevit, R. E. A UbcH5/ubiquitin noncovalent complex is required for processive BRCA1-directed ubiquitination. Molecular Cell. 21 (6), 873-880 (2006).
- Sakata, E., et al. Crystal structure of UbcH5b~ubiquitin intermediate: Insight into the formation of the self-assembled E2~Ub conjugates. Structure. 18 (1), 138-147 (2010).
- Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M., Wolberger, C. Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (10), 915-920 (2006).
- Buetow, L., et al. Activation of a primed RING E3-E2 ubiquitin complex by non-covalent ubiquitin. Molecular Cell. 58 (2), 297-310 (2015).
- Dou, H., Buetow, L., Sibbet, G. J., Cameron, K., Huang, D. T. BIRC7-E2 ubiquitin conjugate structure reveals the mechanism of ubiquitin transfer by a RING dimer. Nature Structural and Molecular Biology. 19 (9), 876-883 (2012).
- McKenna, S., et al. Noncovalent interaction between ubiquitin and the human DNA repair protein Mms2 is required for Ubc13-mediated polyubiquitination. Journal of Biological Chemistry. 276 (43), 40120-40125 (2001).
- Plechanovová, A., et al. Mechanism of ubiquitylation by dimeric RING ligase RNF4. Nature Structural Biology. 18 (9), 1052-1059 (2011).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S. O., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Jain, A. K., Barton, M. C. Regulation of p53: TRIM24 enters the RING. Cell Cycle. 8 (22), 3668-3674 (2009).
- Swatek, K. N., Komander, D. Ubiquitin modifications. Cell Research. 26, 399-422 (2016).
- Yan, K., et al. The role of K63-linked polyubiquitination in cardiac hypertrophy. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (10), 4558-4567 (2018).
- Dammer, E. B., et al. Polyubiquitin linkage profiles in three models of proteolytic stress suggest the etiology of Alzheimer disease. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10457-10465 (2011).
