بروتوكول التشريح الآلي لإثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم
Summary
يوفر التعليق التوضيحي الرقمي مع تشريح الأنسجة الآلي نهجا مبتكرا لإثراء الورم في الحالات ذات المحتوى المنخفض من الورم وهو قابل للتكيف مع كل من أنواع البارافين والأنسجة المجمدة. يعمل سير العمل الموصوف على تحسين الدقة والتكرار والإنتاجية ويمكن تطبيقه على كل من الإعدادات البحثية والسريرية.
Abstract
مطلوب إثراء الورم في الأنسجة منخفضة محتوى الورم ، تلك التي تقل عن 20 ٪ من محتوى الورم اعتمادا على الطريقة ، لتوليد بيانات عالية الجودة بشكل متكرر مع العديد من الفحوصات النهائية مثل تسلسل الجيل التالي. تشريح الأنسجة الآلي هو منهجية جديدة تعمل على أتمتة وتحسين إثراء الورم في هذه الأنسجة الشائعة منخفضة محتوى الورم عن طريق تقليل عدم الدقة المعتمدة على المستخدم للتشريح الكلي التقليدي وقيود الوقت والتكلفة والخبرة للتشريح المجهري لالتقاط الليزر باستخدام تراكب التعليق التوضيحي للصور الرقمية على شرائح غير ملطخة. هنا ، يتم استخدام التعليقات التوضيحية الرقمية للهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) لاستهداف مناطق الورم الصغيرة باستخدام شفرة يبلغ قطرها 250 ميكرومتر2 في الفورمالين غير الملون البارافين الثابت المضمن (FFPE) أو الأقسام المجمدة الطازجة التي يصل سمكها إلى 20 ميكرومتر لإثراء الورم الآلي قبل استخراج الحمض النووي وتسلسل الإكسوم الكامل (WES). يمكن للتشريح الآلي حصاد المناطق المشروحة في أنسجة منخفضة محتوى الورم من أقسام واحدة أو متعددة لاستخراج الحمض النووي. كما يسمح بالتقاط مقاييس جمع واسعة النطاق قبل وبعد الحصاد مع تحسين الدقة وقابلية التكرار وزيادة الإنتاجية باستخدام عدد أقل من الشرائح. يتيح البروتوكول الموصوف التعليق التوضيحي الرقمي مع التشريح الآلي على FFPE الحيواني و / أو البشري أو الأنسجة المجمدة الطازجة ذات المحتوى المنخفض من الورم ويمكن استخدامه أيضا لأي منطقة ذات إثراء ذي أهمية لتعزيز كفاية تطبيقات التسلسل النهائي في سير العمل السريري أو البحثي.
Introduction
يتم استخدام تسلسل الجيل التالي (NGS) بشكل متزايد لكل من رعاية المرضى وفي أبحاث السرطان للمساعدة في توجيه العلاجات وتسهيل الاكتشاف العلمي. غالبا ما تكون الأنسجة محدودة ويتم استخدام عينات صغيرة ذات محتوى ورم متغير بشكل روتيني. وبالتالي، تظل كفاية الورم وسلامته عائقا أمام الحصول على بيانات ذات مغزى. قد تسبب العينات ذات النسب المئوية المنخفضة للورم صعوبة في التمييز بين المتغيرات الحقيقية والقطع الأثرية المتسلسلة وغالبا ما تكون غير مؤهلة للحصول على NGS1. وقد ثبت أن إثراء الورم لحالات محتوى الورم المنخفض ، تلك التي تقل عن 20٪ ، يساعد في إنتاج مواد كافية من أجل توليد بيانات تسلسل قابلة للتكرار وضمان عدم تفويت المتغيرات منخفضة التردد 2,3. ومع ذلك ، ستختلف الحدود اعتمادا على المنصات المستخدمة والاستخدام المخطط للبيانات التي تم إنشاؤها.
تقليديا ، يتم إجراء إثراء مناطق الورم لاستخراجها عن طريق التشريح الكلي اليدوي أو التشريح المجهري لالتقاط الليزر (LCM) لشرائح الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE). يسمح التشريح الكلي اليدوي ، أو كشط مناطق الأنسجة المحددة من الشرائح ، بإزالة مناطق الورم لاستخدامها في الفحوصات النهائية بتكلفة منخفضة نسبيا ، ولكن بدقة منخفضة ودقة منخفضة 2,4. يمكن أن يكون الحد الأدنى من الدقة التقنية فعالا جدا مع حالات محتوى الورم الأعلى حيث توجد مساحات كبيرة من الورم و / أو الحد الأدنى من فقدان الأنسجة لا يؤثر بشكل كبير على النتائج ، ولكن الحالات ذات المحتوى المنخفض للورم أو الحالات ذات الورم الأكثر تشتتا تتطلب دقة أكبر. لذلك تم اختراع LCM في 1990s وأصبح وسيلة قيمة لإزالة المناطق الصغيرة والمحددة والمجهرية بدقة من الأنسجة من شرائح الفورمالين الثابتة البارافين المدمجة (FFPE)5،6،7،8. يمكن استخدام LCM لجمع مجموعات الخلايا الواحدة عند وجود عدم تجانس معقد للعينة9 مما يسمح بجمع مجموعات الخلايا التي كان من الصعب فصلها سابقا. ومع ذلك ، تتطلب LCM آلات مكلفة تتطلب خبرة تقنية واسعة ووقتا عمليا10،11،12،13،14.
تتميز الأداة المستخدمة في تشريح الأنسجة الآلي بدقة بين دقة LCM (~ 10 ميكرومتر) والتشريح الكلي (~ 1 مم)15. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يعرض متطلبات التكلفة والخبرة التقنية بين متطلبات التشريح الكلي و LCM وهو مصمم لإجراء إثراء سريع للأنسجة من شرائح FFPE المتسلسلة للتخفيف من عيوب الطرق السابقة15. يستخدم التشريح الآلي بهذه الطريقة التعليقات التوضيحية الرقمية أو تراكبات الصور المرجعية للشرائح على المسرح على شرائح الأنسجة غير الملطخة المجزأة بشكل متسلسل لتشريح وإثراء المناطق ذات الاهتمام. تستخدم الأداة أطراف طحن شفرة الغزل البلاستيكية ، وأنابيب جمع 1.5 مل ويمكن استخدامها مع عدد من السوائل المختلفة للتشريح لجمع المناطق ذات الأهمية للمقايسات النهائية بما في ذلك استخراج النواة وتسلسلها. يستخدم طرف الطحن البلاستيكي الغزل خزانات برميل المحاقن الداخلية والخارجية ومكبس لجمع المخزن المؤقت ، ثم يطحن ويجمع الأنسجة16. يمكن أن يسمح قطر حجم طرف الطحن المتغير (250 ميكرومتر ، 525 ميكرومتر ، 725 ميكرومتر) بتشريح مناطق الأنسجة المنفصلة للمقارنة ، أو المناطق متعددة البؤر التي يمكن تجميعها أو المناطق الصغيرة الفردية من شرائح FFPE مفردة أو متعددة. يمكن تعديل سمك القسم المستخدم للحصاد بناء على احتياجات التجربة الفردية ويمكن للمستخدمين ضمان عدم استنفاد المناطق ذات الأهمية من خلال إجراء H & E إضافي على قسم تسلسلي واحد مباشرة بعد القسم الأخير المستخدم للحصاد.
تم تحديد التشريح الآلي كوسيلة لإثراء محتوى الورم في حالات محتوى الورم المنخفض وقمنا باختبار وتوسيع الوظيفة المقصودة لأداة تشريح الأنسجة الآلية ، والتي يتم تسويقها حاليا للاستخدام على عينات FFPE السريرية التي يصل سمكها إلى 10 ميكرومتر. يظهر العمل أنه يمكن تطبيق التشريح الآلي على كل من FFPE وأقسام الأنسجة البشرية أو الحيوانية المجمدة الطازجة التي يصل سمكها إلى 20 ميكرومتر لأغراض البحث. يوضح البروتوكول أيضا نهجا لشرح وأتمتة تشريح الورم رقميا لإثراء الورم في الأنسجة ذات المحتوى المنخفض من الورم و / أو الحالات ذات الورم المتداخل والمشتت حيث يكون التشريح الكلي ذي المغزى صعبا أو غير ممكن وإظهار كل من جودة وإنتاجية الحمض النووي الكافي ل NGS. وبالتالي ، يمكن أن يوفر التشريح الآلي دقة متوسطة المستوى وزيادة الإنتاجية لإثراء الورم ويمكن تطبيقه أيضا لإثراء المناطق الأخرى ذات الاهتمام أو دمجه مع منصات أخرى للإجابة على الأسئلة البحثية أو السريرية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يظهر هنا بروتوكول لتطبيق التعليق التوضيحي الرقمي والتشريح الآلي لتشريح مناطق الورم من FFPE منخفض محتوى الورم أو الأنسجة المجمدة الطازجة لإثراء الورم واستخدامه في WES. إن الجمع بين التعليق التوضيحي الرقمي وإنشاء القناع مع التشريح الآلي يقلل بشكل كبير من الوقت العملي المطلوب والخبرة الشائعة …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا كارمينا إسبيريتو وروبن تايلور على دعمهم في تطوير التشريح الآلي وكذلك موظفي مختبر Genentech Pathology Core Laboratory الذين دعموا هذا العمل.
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
References
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center’s experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett’s Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13 (2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482 (2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29 (2013).
