用于低肿瘤含量组织中肿瘤富集的自动解剖方案
Summary
具有自动组织解剖的数字注释为低肿瘤含量病例中的肿瘤富集提供了一种创新方法，并且适用于石蜡和冷冻组织类型。所描述的工作流程提高了准确性，可重复性和通量，可应用于研究和临床环境。
Abstract
低肿瘤含量组织中的肿瘤富集（根据方法而定，肿瘤含量低于20%的组织）需要通过许多下游测定（例如下一代测序）可重复地生成高质量数据。自动组织解剖是一种新方法，通过使用数字图像注释叠加在未染色的载玻片上，减少传统宏观解剖的用户依赖性不精确性以及激光捕获显微切割的时间、成本和专业知识限制，自动化并改善这些常见的低肿瘤含量组织中的肿瘤富集。在这里，数字苏木精和曙红（H&E）注释用于靶向小肿瘤区域，使用直径为250μm2 的刀片在未染色的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）或厚度高达20μm的新鲜冷冻切片中，用于在核酸提取和全外显子组测序（WES）之前自动富集肿瘤。自动解剖可以从单个或多个切片中收获低肿瘤含量组织中的注释区域，以进行核酸提取。它还允许捕获广泛的收获前和收获后收集指标，同时提高准确性，再现性，并通过利用更少的载玻片来提高通量。所描述的方案能够对动物和/或人类FFPE或肿瘤含量低的新鲜冷冻组织进行自动解剖的数字注释，并且还可用于任何感兴趣的区域富集，以提高临床或研究工作流程中下游测序应用的充分性。
Introduction
下一代测序（NGS）越来越多地用于患者护理和癌症研究，以帮助指导治疗和促进科学发现。组织通常受到限制，常规使用肿瘤含量可变的小标本。因此，肿瘤的充分性和完整性仍然是获得有意义数据的障碍。肿瘤百分比较低的样本可能导致难以区分真变异和测序伪影，并且通常不符合NGS1的资格。低肿瘤含量病例（低于20%）的肿瘤富集已被证明有助于产生足够的材料，以产生可重复的测序数据并确保低频变异不被遗漏2，3。但是，限制将根据所使用的平台和计划使用生成的数据而有所不同。
传统上，通过福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）载玻片的手动宏观解剖或激光捕获显微解剖（LCM）进行用于提取的肿瘤区域富集。手动宏观切割或从载玻片中刮除指定组织区域，允许以相对较低的成本去除肿瘤区域以用于下游测定，但准确性低，精度低2，4。对于存在大片肿瘤和/或最小组织损失不会显着影响结果的肿瘤含量较高的病例，最小的技术准确性可能非常有效，但是低肿瘤含量病例或肿瘤更分散的病例需要更高的精确度。因此，LCM是在20世纪90年代发明的，并成为从福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）载玻片5，6，7，8中精确去除组织的小的，定义的微观区域的宝贵方法。当样品存在复杂的异质性9时，LCM可用于收集单细胞群，从而允许收集以前难以分离的细胞群。然而，LCM需要昂贵的机械，需要广泛的技术专长和动手时间10，11，12，13，14。
用于自动组织解剖的仪器的精度介于LCM（~10 μm）和宏观解剖（~1 mm）之间15。此外，它表现出大等离子切割和LCM之间的成本和技术专业知识要求，旨在从序贯FFPE载玻片中进行快速组织富集，以减轻先前方法的缺点15。以这种方式自动解剖利用数字注释或台上载玻片参考图像叠加到连续切片的未染色组织载玻片上，以解剖和丰富感兴趣的区域。该仪器使用塑料纺丝刀片铣削尖端，1.5 mL收集管，可与许多不同的流体一起使用进行解剖，以收集感兴趣的区域以进行下游测定，包括核提取和测序。所述纺丝塑料碾磨尖端利用注射器桶内和外贮存器和柱塞来收集缓冲液，然后碾磨并收集组织16。可变的铣刀头尺寸直径（250 μm，525 μm，725 μm）可以解剖单独的组织区域进行比较，可以合并的多焦点区域或来自单个或多个FFPE载玻片的单个小区域。用于收获的切片厚度可以根据个人实验需求进行调整，用户可以通过在用于收获的最后一个切片之后立即对一个连续切片进行额外的H&E来确保感兴趣的区域没有被耗尽。
自动解剖被确定为在低肿瘤含量病例中富集肿瘤含量的一种方式，我们测试并扩展了自动组织解剖仪器的预期功能，该仪器目前销售用于厚度高达10μm的FFPE临床标本。该研究表明，自动解剖可以应用于FFPE和厚度达20μm的新鲜冷冻人或动物组织切片，用于研究目的。该协议还展示了一种在肿瘤含量低的组织和/或具有嵌套，分散肿瘤的病例中以数字方式注释和自动解剖以肿瘤富集的方法，在这些病例中，有意义的大切剖具有挑战性或不可行，并显示足以用于NGS的核酸的质量和产量。因此，自动解剖可以为肿瘤富集提供中级精度和更高的通量，也可以应用于丰富其他感兴趣的区域，或与其他平台结合使用以回答研究或临床问题。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍的是一种方案，用于应用数字注释和自动解剖，以从低肿瘤含量FFPE或新鲜冷冻组织中解剖肿瘤区域，以进行肿瘤富集并在WES中使用。将数字注释和面罩创建与自动解剖相结合，可显著减少经典肿瘤富集方法（包括手动大切除和LCM）所需的动手时间和专业知识。该协议展示了一种潜在的重要的中程肿瘤富集选择，该选项不仅允许低肿瘤含量富集，而且在难以从肿瘤相邻的正常组织解剖分布…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢Carmina Espiritu和Robin E. Taylor在自动解剖开发方面的支持，以及支持这项工作的Genentech病理学核心实验室工作人员。
Materials
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Fill Station | Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Head | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Milling Tips Small | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifuge |
| Incubation Buffer | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Automated stainer |
| Molecular Grade Mineral Oil | Sigma | M5904-500ML | |
| Proteinase K | Promega | V302B | Digestion buffer |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| RLT Plus buffer | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 |
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